BCR/ABL: Von den molekularen Mechanismen der Leukämie-Induktion zur Behandlung der chronischen myeloischen Leukämie

Inhibitoren des BCR/ABL-Fusionsproteins

Da die deregulierte Tyrosinkinase-Aktivität von p210BCR/ABL als wesentliches transformierendes Ereignis bei der CML bekannt ist, wurden Studien zur Hemmung dieser TK-Aktivität initiiert (Lugo et al., 1990; Oda et al., 1995).

Sehr viele Tyrosinkinase-Inhibitoren wurden in CML-Zellen untersucht (Boutin, 1994; Levitzki und Gazit, 1995). Die ersten, die getestet wurden, wurden aus natürlichen Quellen isoliert, wie die Antibiotika Herbimycin-A, Genistein und Erbstatin, die die p210BCR/ABL-TK-Aktivität in vitro hemmen, das Wachstum von BCR/ABL+-Zelllinien in vitro hemmen und die erythroide Differenzierung der K562-Zelllinie induzieren (Carlo-Stella et al., 1996; Honma et al., 1989, 1990; Kawada et al., 1993; Okabe et al., 1992). Synthetische Verbindungen, Tyrphostine, wurden daraufhin entwickelt und AG957 und AG568 identifiziert, die die p210BCR/ABL TK-Aktivität in vitro hemmen und die erythroide Differenzierung und Apoptose der K562-Zelllinie induzieren (Anafi et al., 1993). Außerdem stellt AG957 die β1-Integrin-vermittelte Adhäsion von primären CML-Zellen wieder her (Bhatia et al., 1998). AG957 hat auch einen synergistischen antiproliferativen Effekt mit dem Anti-Fas-Rezeptor auf CML-Progenitoren (Carlo-Stella et al., 1999). Allerdings ist die geringe Spezifität für die BCR/ABL-TK-Aktivität eine wesentliche Einschränkung dieser TK-Inhibitoren.

STI571

In den späten 1980er Jahren wurde ein 2-Phenylaminopyrimidin mit spezifischer Tyrosinkinase-Hemmaktivität gegen den Thrombozyten-Wachstumsfaktor-Rezeptor (PDGF-R), C-Kit und ABL-Tyrosinkinase, STI571 (früher CGP57148, jetzt Glivec oder Imatinibmesylat), identifiziert (Buchdunger et al, 1996; Druker und Lydon, 2000). Wie Tyrphostine wirkt STI571 durch Bindung an die hochkonservierte Nukleotid-Bindungstasche der katalytischen Domäne der ABL-TK und blockiert kompetitiv die Bindung von ATP (Schindler et al., 2000).

Präklinische Studien zeigten, dass STI571 spezifisch die Proliferation leukämischer Zellen hemmt und das Interleukin-3 (IL-3) abhängige Wachstum und die Differenzierung von BCR/ABL+ Zelllinien wiederherstellt. Das Wachstum von myeloischen koloniebildenden CML-Zellen wird durch STI571 stark gehemmt, mit minimaler Wirkung auf das Wachstum normaler Kolonien (Carroll et al., 1997; Deininger et al., 1997; Druker et al., 1996; Gambacorti-Passerini et al., 1997). Dies ist auf die Hemmung der Proliferation und in geringerem Ausmaß auf den Zelltod zurückzuführen (Holtz et al., 2002). Die Langzeitkultur von BM-Zellen mit längerer Exposition mit STI571 zeigte eine hemmende Wirkung auf CML-Vorläuferzellen bei geringer Toxizität für normale Zellen (Kasper et al., 1999). Allerdings überleben bis zu 30-40% der Ph+ LTC-IC die Behandlung mit STI571 (Holtz et al., 2002). Darüber hinaus führt die Hemmung der BCR/ABL-Kinase-Aktivität durch STI571 zu einer transkriptionellen Modifikation verschiedener Gene, die an der Kontrolle des Zellzyklus, der Zelladhäsion und der Organisation des Zytoskeletts beteiligt sind (Deininger et al., 2000), was zum apoptotischen Tod zumindest einiger Ph+ Zellen führt. Studien an Mäusen zeigten eine in vivo Wirkung von STI571 gegen BCR/ABL+ Zellen. Allerdings war eine kontinuierliche Exposition mit STI571 notwendig, um 32DBCR/ABL-generierte Tumoren zu beseitigen (le Coutre et al., 1999). Vor der klinischen Prüfung wurde gezeigt, dass STI571 ein akzeptables Toxizitätsprofil bei Tieren aufweist (Druker und Lydon, 2000).

Im Juni 1998 wurde eine klinische Studie der Phase I mit STI571 gestartet (Druker et al., 2001b). Bei dieser Studie handelte es sich um eine Dosis-Eskalationsstudie, die die maximal verträgliche Dosis bei 54 Patienten in der chronischen Phase der CML ermitteln sollte, bei denen eine IFN-α-Therapie versagt hatte. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Die Nebenwirkungen waren minimal, es gab keine dosislimitierende Toxizität.

Die Phase-I-Studien wurden auf CML-Patienten in myeloischer und lymphoider Blastenkrise und Patienten mit rezidivierter oder refraktärer Ph-positiver ALL ausgeweitet. Die Patienten wurden mit täglichen Dosen von 300-1000 mg STI571 behandelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst. STI571 hat eine bemerkenswerte Einzelwirkungsaktivität in der CML-Blastkrise und der Ph-positiven ALL, aber die Reaktionen sind in der Regel nicht dauerhaft (Druker et al., 2001a).

An die Phase I schloss sich zwischen Dezember 1999 und Mai 2000 eine große internationale Phase II-Studie an, um die Sicherheit und Wirksamkeit von STI571 bei interferonrefraktären und interferonintoleranten Ph-positiven CML-Patienten sowie bei CML-Patienten in der akzelerierten Phase, CML in myeloischer Blastenkrise und Ph-positiven ALL-Patienten zu untersuchen (Kantarjian et al., 2002; Sawyers et al., 2000; Talpaz et al., 2002). In diese Studie wurden über 1000 Patienten in 27 Zentren in sechs Ländern über einen Zeitraum von 6-9 Monaten aufgenommen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Die Studie bestätigte die Ergebnisse der Phase I und diente als Grundlage für die beschleunigte Zulassung von STI572 durch die Food and Drug Administration (FDA).

Seitdem eine randomisierte Phase-III-Studie, die STI571 mit Interferon und Cytarabin bei neu diagnostizierten Patienten vergleicht, über 1000 Patienten in einem Zeitraum von sechs Monaten aufgenommen, und die Datenerfassung läuft weiter.

Klinisch gesehen liegt bei der Mehrzahl der Patienten, die nach einem ersten Ansprechen auf STI571 einen Rückfall erleiden, eine Reaktivierung der BCR/ABL-Kinase vor (Gorre et al., 2001). In-vitro-Studien an murinen und humanen BCR/ABL-positiven Zelllinien, die gegen STI571 resistent sind, haben gezeigt, dass ein häufiger Mechanismus der Resistenz gegen STI571 die Amplifikation und Überexpression des BCR/ABL-Gens ist (le Coutre et al., 2000; Mahon et al., 2000). Eine Überexpression des Pgp-Glykoproteins, dem Produkt des Multidrug Resistance (MDR)-Gens, kann ebenfalls zum resistenten Phänotyp beitragen. Ungefähr ein Drittel der Patienten, die nach einem ersten Ansprechen einen Rückfall erleiden, haben eine BCR/ABL-Amplifikation (Gorre et al., 2001). Interessanterweise hat die Hälfte dieser Patienten Punktmutationen in der ABL-Kinasedomäne entwickelt, die zu einer verminderten Empfindlichkeit gegenüber STI571 führen (Barthe et al., 2001; Gorre et al., 2001; Hochhaus et al., 2001). Mindestens eine der Punktmutationen befindet sich an einer Stelle, die als Kontaktstelle zwischen der ABL-Kinase und STI571 vorhergesagt wird (Gorre et al., 2001). Mehrere Punktmutationen befinden sich an Resten, die an Kontaktstellen angrenzen, während andere in der Kinase-Aktivierungsschleife liegen (Barthe et al., 2001; Gorre et al., 2001; Hochhaus et al., 2001). Eine BCR/ABL-Mutation oder -Amplifikation wurde bei Patienten mit de novo-Resistenz gegen STI571 jedoch nicht häufig beobachtet, und es werden derzeit Studien durchgeführt, um den Mechanismus der primären Resistenz bei diesen Patienten zu identifizieren.

Die Hemmung der ABL-, PDGF-Rezeptor- und c-kit-Rezeptor-Kinase-Aktivität durch STI571 kann möglicherweise die normale Zellfunktion beeinträchtigen. Das vernachlässigbare Ausmaß an Nebenwirkungen, das in den klinischen Studien mit STI571 beobachtet wurde, deutet jedoch darauf hin, dass alternative Signalwege die Suppression der normalen ABL-, PDGF- und c-kit-Kinasen kompensieren könnten.

Inhibitoren anderer Signaltransduktionsproteine

Farnesyltransferase-Inhibitoren (FTI)

Diese Strategie basiert auf der Vorstellung, dass die RAS-Aktivierung eine zentrale Rolle bei der leukämogenen Transformation durch BCR/ABL spielt (Cortez et al., 1996; Goga et al., 1995; Mandanas et al., 1993; Pendergast et al., 1993; Puil et al., 1994; Sanchez-Garcia und Martin-Zanca, 1997; Sawyers et al., 1995; Senechal et al., 1996). Die Hemmung der RAS-Signalübertragung durch Expression von dominant-negativem RAS, die Blockierung der Funktion des Grb2-Adaptorproteins oder die Inkubation mit Antisense-Oligonukleotiden gegen p21Ras verhindert die BCR/ABL-Transformation in mehreren Zelllinienmodellen (Gishizky et al., 1995; Sawyers et al., 1995; Sakai et al., 1994; Skorski et al., 1994a). Die Funktion von Ras hängt von der korrekten subzellulären Lokalisierung an der Plasmamembran durch die Addition einer 15-Kohlenstoff-Farnesylgruppe an Ras ab, eine Reaktion, die durch das Enzym Farnesylproteintransferase (FPT) katalysiert wird (Gutierrez et al., 1989; Hancock et al., 1989; Long et al., 2001; Reiss et al., 1990; Stokoe et al., 1994). Farnesyl-Protein-Transferase-Inhibitoren (FTI) sind eine Klasse von Medikamenten, die spezifisch die onkogene Ras-Signalisierung und die Ras-abhängige zelluläre Transformation blockieren (Gibbs et al., 1994). FTI unterbrechen die Prenylierung von Ras und ohne die richtige subzelluläre Lokalisierung ist Ras nicht mehr onkogen (Kato et al., 1992). Mehrere Studien haben die potente Antitumoraktivität von FTI in vitro gegen Ras-transformierte murine und humane Krebszellen und in vivo gegen Ras-spezifische Tumorbildung in transgenen und Xenograft-Mausmodellen gezeigt (End, 1999; Gibbs et al., 1997; Kohl et al., 1993, 1994; Nagasu et al., 1995; Rowinsky et al., 1999). Es wurde jedoch berichtet, dass FTI auch das Wachstum von transformierten Zellen hemmen, denen das mutierte Ras fehlt, was darauf hindeutet, dass auch andere Mechanismen beteiligt sind (Liu et al., 1998; Sepp-Lorenzino et al., 1995). Zum Beispiel werden einige Proteinsubstrate in Gegenwart von hemmenden Dosen von FTI durch die Geranyl-Gerenanyl-Protein-Transferase alternativ prenyliert. Eine alternativ prenylierte Form von RhoB übt anti-proliferative Effekte auf transformierte Zellen aus (Lebowitz et al., 1997; Lebowitz und Prendergast, 1998). Letztere könnte für die von FTI beobachtete Wirkung auf die Zellproliferation verantwortlich sein. Ermutigende Vorstudien dokumentierten, dass FTI in vitro die Proliferation von ALL- und juvenilen chronischen myeloischen Leukämiezellen (JCML) hemmt (Emanuel et al., 2000). Eine Phase-I-Dosis-Eskalationsstudie wurde mit dem FTI R115777 bei 35 Erwachsenen mit refraktären und rezidivierten akuten Leukämien durchgeführt (Karp et al., 2001). Klinische Reaktionen traten bei 29% der 34 auswertbaren Patienten auf, darunter zwei komplette Remissionen. Die Ergebnisse dieser Studie liefern den ersten Beweis für eine erfolgreiche Hemmung von FT in neoplastischen Zellen in vivo und deuten darauf hin, dass FTI eine vielversprechende antileukämische Modalität sein könnte.

Darüber hinaus hemmt SCH66336, ein orales FTI, potentiell die Soft-Agar-Koloniebildung, verlangsamte die Proliferation und sensibilisierte BCR/ABL+ Zelllinien für apoptotische Stimuli (Peters et al., 2001). Wenn SCH66336 Mäusen mit BCR/ABL-induzierter Leukämie verabreicht wurde, erhöhte sich die Überlebenszeit von 4 Wochen (ohne Therapie) auf mehr als ein Jahr. Wenn SCH66336 jedoch abgesetzt wurde, entwickelten die Tiere Leukämie. Die Fähigkeit von SCH66336, die Koloniebildung von primären CML-Zellen zu hemmen, wurde ebenfalls nachgewiesen (Peters et al., 2001). Diese Ergebnisse zeigen, dass FTI-Verbindungen als Einzelwirkstoffe gegen BCR/ABL-transformierte hämatopoetische Zellen hochwirksam sind, was FTIs als potenzielle klinische Behandlung für BCR/ABL-induzierte Leukämie identifiziert. Eine weitere Studie berichtete über die Wirksamkeit von SCH66336 bei der Behandlung von BCR/ABL-positiver akuter lymphoblastischer Leukämie in P190 transgenen Mäusen (Reichert et al., 2001). In weiteren präklinischen Tierstudien soll geklärt werden, ob der Einsatz von FTI in Kombination mit anderen Therapien, wie z.B. Tyrosinkinase-Inhibitoren, zur Behandlung von BCR/ABL-induzierter Leukämie sinnvoll ist.

Proteasom-Inhibitoren

Das Proteasom ist eine multikatalytische Protease, die in allen eukaryontischen Zellen vorkommt und die primäre Komponente des Proteinabbauweges der Zelle darstellt. Durch den Abbau regulatorischer Proteine (An et al., 2000; Dietrich et al., 1996; Pagano et al., 1995; Wu et al., 2000) ist das Proteasom der Schlüssel zur Aktivierung oder Unterdrückung vieler zellulärer Prozesse, einschließlich der Zellzyklusprogression und Apoptose (Adams et al., 1999; Imajoh-Ohmi et al., 1995). In-vitro- und Maus-Xenograft-Studien haben eine Antitumor-Aktivität von Proteasom-Inhibitoren bei einer Vielzahl von Tumorarten gezeigt, darunter Pankreas-, Prostata- und Dickdarmkrebs, Myelom und chronische lymphatische Leukämie (Adams, 2002; Hideshima et al., 2001; Shah et al., 2001). Mehrere Studien haben die Hypothese untersucht, dass das Proteasom eine Rolle bei der Regulation der BCR/ABL-Funktion spielen könnte. Effekte von Proteasom-Inhibitoren wie Tripeptid-Aldehyde, Lactacystin und PSI wurden in verschiedenen humanen leukämischen Zelllinien untersucht. Die Proteasom-Inhibition führt in einer Reihe von myeloischen Zelllinien zu einem erhöhten apoptotischen Tod und einer Verstärkung der Wirkung von zytotoxischen Medikamenten (Dou et al., 1999; Drexler, 1997; Shinohara et al., 1996; Soligo et al., 2001). Dieser Prozess beinhaltet die Aktivierung von Caspasen, eine Störung der Expression von Proteinen der Bcl-2-Familie und eine verminderte Expression von p210BCR/ABL. Interessanterweise senken Proteasom-Inhibitoren zunächst die p210BCR/ABL-Tyrosinkinase-Aktivität und aktivieren anschließend das apoptotische Todesprogramm in K562-Zellen (Soligo et al., 2001). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Inaktivierung der BCR/ABL-Funktion durch Proteasom-Inhibitoren für die Induktion der Apoptose in leukämischen Zelllinien essentiell ist. In primären Zellen ist die Empfindlichkeit gegenüber PSI in CML CD34+ Progenitoren dreifach höher als in normalen Progenitoren. Die Beobachtung, dass transformierte Zellen empfindlicher auf die Blockade des Proteasoms reagieren als normale Zellen, wurde in leukämischen Zellen im Vergleich zu normalen Zellen berichtet (Adams, 2002). Während der genaue Mechanismus für diese unterschiedliche Anfälligkeit nicht vollständig geklärt ist, könnte die Proteasom-Inhibition einige der Veränderungen rückgängig machen, die die Proliferation ermöglichen und die Apoptose in malignen Zellen unterdrücken. Der Proteasom-Inhibitor PS-341 war der erste Proteasom-Inhibitor, der in Studien am Menschen eingesetzt wurde. Sechs klinische Studien der Phase I für PS-341 bei hämatologischen Malignomen oder soliden Tumoren sind bereits abgeschlossen oder werden derzeit durchgeführt (Papandreou et al., 2001; Stinchcombe et al, 2000), und die Sicherheit und Wirksamkeit der PS-341-Behandlung bei refraktärem multiplem Myelom und CLL wird in zwei laufenden Phase-II-Studien getestet.

Immunmodulation

Dies wird nur kurz besprochen und wir verweisen die Leser auf exzellente Reviews, die kürzlich veröffentlicht wurden (Apperley et al, 1998; Campbell et al., 2001; Clark und Christmas, 2001; Claxton et al., 2001; Dazzi et al., 1999; Goodman et al., 1998; Pinilla-Ibarz et al., 2000b).

Die Infusion von Spender-Lymphozyten bei CML-Patienten, die nach einer allogenen Stammzelltransplantation (SCT) einen Rückfall erlitten haben, erhöht die langfristige Remissionsrate signifikant (Kolb et al., 1995). Obwohl der Mechanismus nicht vollständig geklärt ist, beweist dies, dass immunregulatorische Zellen spezifisch leukämische Vorläufer- und Stammzellen eliminieren können. Die mit dieser Therapie verbundene GVHD stellt die größte Einschränkung für diese Therapie dar. Die selektive Depletion von CD8+ T-Lymphozyten des Spenders oder die Transduktion von T-Lymphozyten des Spenders mit dem Herpes Simplex Thymidinkinase-Gen kann es den Klinikern jedoch ermöglichen, die GVHD zu kontrollieren (Ackerman et al., 1978; Barrett et al., 1998; Giralt et al., 1995; Nimer et al., 1994; Tiberghien et al., 1994). Die Kokultur von Spender-Lymphozyten mit leukämischen Wirtszellen oder Antigen-präsentierenden leukämischen dendritischen Zellen von CML-Patienten kann durchgeführt werden, um ex vivo CTLs zu generieren und zu expandieren, die spezifisch gegen CML-Vorläuferzellen reaktiv sind (Choudhury et al., 1997; Faber et al., 1995; Falkenburg et al., 1993; Jiang und Barrett, 1995; Molldrem et al., 1997; Warren et al., 1998). Die Entwicklung von CML-Vakzinen ist ein weiterer wertvoller Ansatz. Bei dieser Therapie werden BCR/ABL-spezifische Peptide auf MHC-Molekülen exprimiert, um eine leukämiespezifische CTL-Antwort zu erzeugen. Mehrere Studien haben die Entwicklung einer spezifischen Immunantwort gezeigt. Ob solche Impfstoffe ausreichen, um CML effektiv zu behandeln, bleibt abzuwarten (Bocchia et al., 1995, 1996; Bosch et al., 1996; Pinilla-Ibarz et al., 2000a; ten Bosch et al, 1999).

Die Verabreichung von niedrigen oder mittleren Dosen von IL2 nach allogener SZT oder die Expansion ex vivo von autologen NK-Zellen mit IL2 vor der Reinfusion erhöht die Anzahl und Aktivierung der NK-Zellen bei CML-Patienten und kann hilfreich sein, um minimale Resterkrankungen zu beseitigen (Robinson et al., 1996; Soiffer et al., 1994; Vey et al., 1999).