Cebador (biología molecular)
Los cebadores sintéticos son oligonucleótidos sintetizados químicamente, generalmente de ADN, que se pueden personalizar para recocer en un sitio específico del ADN molde. En solución, el cebador se hibrida espontáneamente con el molde mediante el emparejamiento de bases Watson-Crick antes de ser extendido por la ADN polimerasa. La capacidad de crear y personalizar cebadores sintéticos ha demostrado ser una herramienta inestimable necesaria para una variedad de enfoques biológicos moleculares que implican el análisis del ADN. Tanto el método de terminación en cadena de Sanger como el método «Next-Gen» de secuenciación de ADN requieren cebadores para iniciar la reacción.
Diseño de cebadores de PCREditar
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utiliza un par de cebadores personalizados para dirigir la elongación del ADN entre sí en los extremos opuestos de la secuencia que se está amplificando. Estos cebadores suelen tener una longitud de entre 18 y 24 bases, y deben codificar únicamente los sitios específicos aguas arriba y aguas abajo de la secuencia que se está amplificando. Un cebador que pueda unirse a múltiples regiones a lo largo del ADN las amplificará todas, eliminando el propósito de la PCR.
Al diseñar un par de cebadores para la PCR deben tenerse en cuenta algunos criterios. Los pares de cebadores deben tener temperaturas de fusión similares, ya que el recocido durante la PCR se produce para ambas cadenas simultáneamente, y esta temperatura de fusión compartida no debe ser ni muy superior ni muy inferior a la temperatura de recocido de la reacción. Un cebador con una Tm (temperatura de fusión) demasiado alta que la temperatura de recocido de la reacción puede deshibridarse y extenderse en un lugar incorrecto de la secuencia de ADN. Una Tm significativamente más baja que la temperatura de recocido puede no recobrar y extenderse en absoluto.
Además, las secuencias de los cebadores deben elegirse para seleccionar de forma exclusiva una región de ADN, evitando la posibilidad de hibridación con una secuencia similar cercana. Un método comúnmente utilizado para seleccionar un sitio de cebador es la búsqueda BLAST, mediante la cual se pueden ver todas las posibles regiones a las que se puede unir un cebador. Tanto la secuencia de nucleótidos como el propio cebador pueden buscarse mediante BLAST. La herramienta gratuita del NCBI Primer-BLAST integra el diseño de cebadores y la búsqueda BLAST en una sola aplicación, al igual que los productos de software comerciales como ePrime y Beacon Designer. Se pueden realizar simulaciones por ordenador de los resultados teóricos de la PCR (PCR electrónica) para ayudar en el diseño de cebadores dando las temperaturas de fusión y recocido, etc.
Hay muchas herramientas en línea disponibles de forma gratuita para el diseño de cebadores, algunas de las cuales se centran en aplicaciones específicas de la PCR. Las populares herramientas Primer3Plus y PrimerQuest pueden utilizarse para encontrar cebadores que cumplan con una amplia variedad de especificaciones. Los cebadores altamente degenerados para dirigirse a una amplia variedad de plantillas de ADN pueden diseñarse de forma interactiva con GeneFISHER. Los cebadores con alta especificidad para un subconjunto de plantillas de ADN en presencia de muchas variantes similares pueden diseñarse utilizando DECIPHER. El diseño de los cebadores tiene como objetivo generar un equilibrio entre la especificidad y la eficiencia de la amplificación.
La selección de una región específica del ADN para la unión del cebador requiere algunas consideraciones adicionales. Deben evitarse las regiones con muchas repeticiones de mononucleótidos y dinucleótidos, ya que puede producirse la formación de bucles y contribuir a la hibridación errónea. Los cebadores no deben recocer fácilmente con otros cebadores de la mezcla; este fenómeno puede dar lugar a la producción de productos «dímeros de cebadores» que contaminen la solución final. Los cebadores tampoco deben recocer fuertemente con ellos mismos, ya que las horquillas y bucles internos podrían dificultar el recocido con el ADN molde.
Cuando se diseñan cebadores, pueden añadirse bases nucleotídicas adicionales a los extremos posteriores de cada cebador, lo que da lugar a una secuencia de tapa personalizada en cada extremo de la región amplificada. Una de las aplicaciones de esta práctica es para su uso en la clonación TA, una técnica especial de subclonación similar a la PCR, en la que se puede aumentar la eficiencia añadiendo colas AG a los extremos 5′ y 3′.
Cartillas degeneradasEditar
Algunas situaciones pueden requerir el uso de cebadores degenerados. Se trata de mezclas de cebadores que son similares, pero no idénticos. Pueden ser convenientes cuando se amplifica el mismo gen de diferentes organismos, ya que las secuencias son probablemente similares pero no idénticas. Esta técnica es útil porque el propio código genético es degenerado, lo que significa que varios codones diferentes pueden codificar el mismo aminoácido. Esto permite que diferentes organismos tengan una secuencia genética significativamente diferente que codifique una proteína muy similar. Por esta razón, los cebadores degenerados también se utilizan cuando el diseño del cebador se basa en la secuencia de la proteína, ya que no se conoce la secuencia específica de los codones. Por lo tanto, la secuencia del cebador correspondiente al aminoácido isoleucina podría ser «ATH», donde la A representa la adenina, la T la timina y la H la adenina, la timina o la citosina, según el código genético de cada codón, utilizando los símbolos de la IUPAC para las bases degeneradas. Los cebadores degenerados pueden no hibridar perfectamente con una secuencia diana, lo que puede reducir en gran medida la especificidad de la amplificación por PCR.
Los cebadores degenerados son ampliamente utilizados y extremadamente útiles en el campo de la ecología microbiana. Permiten la amplificación de genes de microorganismos hasta ahora no cultivados o permiten la recuperación de genes de organismos de los que no se dispone de información genómica. Normalmente, los cebadores degenerados se diseñan alineando las secuencias de los genes que se encuentran en el GenBank. Las diferencias entre las secuencias se tienen en cuenta utilizando las degeneraciones de la IUPAC para las bases individuales. Los cebadores PCR se sintetizan entonces como una mezcla de cebadores correspondientes a todas las permutaciones de la secuencia de codones.