Modelos de visión aviar y experimentos de campo determinan el valor de supervivencia del camuflaje de la polilla del pimiento

Fotografías de colecciones de museos

Se necesitaron fotografías de ejemplares de la polilla del pimiento (Biston betularia) para el análisis de imágenes digitales. Se obtuvieron datos fotográficos de tres museos del sur de Inglaterra: El Museo y Galería de Arte de Bristol, el Arca de Exeter del Museo y Galería de Arte Royal Albert Memorial, y el Museo de Historia Natural de la Universidad de Oxford. Las colecciones de Oxford son dignas de mención porque contienen los especímenes recogidos por Kettlewell para sus experimentos originales de depredación y cría de aves. Se permitió el acceso a los cajones de especímenes para seleccionar las formas más intactas de typica y carbonaria de ambos sexos para el muestreo, con una selección basada en la integridad de las alas. Debido a la edad y a la fragilidad de estos especímenes, el cuidado en la manipulación de los insectos con alfileres era primordial.

Utilizamos una cámara Nikon D7000 DSLR que había sido sometida previamente a una conversión de cuarzo (Advanced Camera Services Limited, Norfolk, Reino Unido) mediante la sustitución del filtro UV interno por una lámina de cuarzo transparente, según estudios anteriores22,48. Esto permitió una sensibilidad espectral completa en todo el espectro aviar-visible. Se adjuntó un objetivo intercambiable CoastalOpt 105 mm UV Macro APO con el que se tomaron fotografías en el espectro visible humano con un filtro de bloqueo UV-IR de Baader (que transmite 400-700 nm) y fotografías ultravioletas (UV) con un filtro de paso UV de Baader (que transmite 315-400 nm)23. Todas las imágenes se tomaron en formato RAW. Se seleccionó un área dentro de las colecciones con una cantidad mínima de luz natural y artificial para no interferir con el equipo de iluminación, que consistía en una lámpara de arco de color Iwasaki EYE conectada a un balastro Ventronic, montada en un soporte de iluminación fotográfica PhotxPro con un paraguas Elinchrom acoplado. La lámpara de arco se dejó calentar durante 15 minutos para que la bombilla alcanzara al menos el 90% de su potencia lumínica total. Antes de utilizarla, se retiró el filtro de bloqueo UV aplicado sobre la lámpara de arco con un cepillo de acero para permitir un espectro completo de longitudes de onda. Se colocó una lámina cilíndrica de PTFE alrededor de la bombilla, o alrededor del espécimen o espécimenes que se iban a fotografiar si eran accesibles, para difundir uniformemente la luz.

Si era apropiado, se extrajo una polilla del cajón de especímenes y se fijó con alfileres sobre un fondo de espuma gris neutro. Se fotografiaron un máximo de tres especímenes por toma para garantizar que todos tuvieran un tamaño uniforme y que las alas no estuvieran fuera del encuadre. Para eliminar cualquier efecto de la variabilidad de la iluminación, se incluyó un estándar de reflectancia claro (95%) y oscuro (5%) (Labsphere, Congleton, Reino Unido) junto con una barra de escala colocada en el lado más cercano a los especímenes. La cámara se colocó directamente en la parte superior utilizando un soporte para copias o un trípode con cabeza flexible, antes de enfocar para obtener una nitidez óptima. El tiempo de exposición se seleccionó en función de si se fotografiaba con el filtro visible o con el UV y se optimizó para obtener una exposición correcta y evitar la saturación49. Se utilizó un control remoto del obturador de la cámara para minimizar el ruido o el movimiento innecesario.

Análisis del camuflaje del fondo natural de reposo

Se exploró el camuflaje críptico entre la polilla del pimiento y sus fondos naturales de reposo mediante la modelización de la visión aviar para comparar los contrastes cromáticos y acromáticos. Se visitaron bosques en zonas poco contaminadas para obtener fotografías in situ de cortezas de árboles lisas y fotos de cortezas con líquenes crustáceos. Se seleccionaron robles (Quercus robar) y fresnos (Fraxinus excelsior) en función de su idoneidad como fondos naturales de descanso, tal y como se identificó en anteriores experimentos con la polilla de la pimienta21,28. La selección de especies de líquenes crustáceos, Lecidella elaeochroma y Graphis scripta, en contraposición a los líquenes foliosos, se basó en trabajos anteriores4,21,45, y porque los experimentos anteriores muestran que los líquenes crustáceos se localizan más comúnmente en los troncos de los árboles y en los lados inferiores de las ramas principales28, que son los lugares de descanso naturales más frecuentados por la polilla del pimiento11. Las poblaciones ancestrales que se encuentran en las ramas superiores apoyan el uso de líquenes foliosos, mientras que los líquenes crustáceos florecen debajo de las ramas en lugares no contaminados4. Se seleccionaron 130 árboles individuales de acuerdo con la idoneidad anteriormente señalada, fotografiando 65 especímenes de corteza lisa y 65 de corteza cubierta de líquenes bajo luz neutra durante las horas de luz del día, utilizando la misma cámara Nikon D7000 y los mismos objetivos de la colección de especímenes del museo. Se colocó un estándar de reflectancia clara y oscura y una barra de escala en cada fotografía para corregir la escala y cualquier diferencia de iluminación encontrada durante el análisis de la imagen.

Para preparar las imágenes para el análisis, cada foto se convirtió en una imagen multiespectral utilizando el software de acceso abierto ImageJ50 con el plugin Image Calibration and Analysis Toolbox23. Se seleccionó una imagen RAW tanto en el UV como en el visible para cada espécimen, y se examinó previamente para comprobar si había sobreexposición. Los estándares de reflectancia clara y oscura se seleccionaron individualmente para normalizar los canales y tener en cuenta la posible variación de las condiciones de luz49. A continuación, se realizó una alineación manual en los canales visibles RGB y UV de la pila de imágenes multiespectrales de 32 bits para obtener mediciones de color precisas. Para cada muestra de los dos tipos de fondo diferentes, se comparó una vez un único morfo de polilla typica o carbonaria mediante una selección aleatoria, para determinar el contraste de color y luminancia (luminosidad) entre la polilla y su fondo.

Para modelar la visión de los depredadores aviares, se seleccionó el herrerillo (Cyanistes caeruleus) porque estudios anteriores han demostrado que atacan a la polilla del pimiento10,11, su comportamiento de búsqueda de alimento puede verse afectado por las señales UV51, y en general su sistema visual es representativo de muchas aves paseriformes superiores19,52. En primer lugar, utilizamos un método bien establecido para convertir las imágenes calibradas de la cámara en el espacio de color de los animales (datos de respuesta de los conos predichos) utilizando una técnica de mapeo polinómico23,49,53 en condiciones de iluminación D65 (luz diurna). Este método es muy preciso a la hora de generar datos de respuesta de los conos en comparación con la modelización mediante espectros de reflectancia23,54,55. Aunque podríamos haber utilizado un espectro de irradiación diferente (como una sombra de bosque verde), esto no habría afectado a los resultados por varias razones. En primer lugar, el bosque no es, de hecho, una sombra continua, sino parches de árboles y claros y, por tanto, una mezcla de cielos abiertos e iluminación de sombra de bosque. Además, las polillas reales y los modelos aquí presentes estarían expuestos a una serie de condiciones de luz asociadas con la hora del día, la profundidad de la cubierta forestal/vegetal y el clima. Además, al igual que la mayoría de los modelos visuales, tenemos en cuenta el proceso de constancia del color, a través de la llamada transformación de von Kries56,57, y como tal, el uso de un espectro de irradiación diferente ha demostrado tener poco efecto en los valores de captura de conos previstos57,58. Por último, para demostrar plenamente que nuestro modelo es robusto para la iluminación, comparamos los valores de captura de conos predichos para 16 polillas (ocho typica y ocho carbonaria) bajo espectros de irradiación D65 y de sombra de bosque. Como se esperaba, los resultados no cambiaron, con los siguientes valores de captura de conos de media más desviación estándar: doble (bosque = 0,22 ± 0,13, D65 = 0,21 ± 0,13), onda larga (bosque = 0,27 ± 0.15, D65 = 0,27 ± 0,15), onda media (bosque = 0,20 ± 0,13, D65 = 0,20 ± 0,13), onda corta (bosque = 0,14 ± 0,10, D65 = 0,14 ± 0,10), ultravioleta (bosque = 0,08 ± 0,06, D65 = 0,07 ± 0,06). En todos los casos, hubo una correlación muy fuerte y significativa entre los valores de captura de conos en las dos condiciones de luz (pruebas de correlación de rango de Spearman entre bosque y D65 para todos los receptores: p < 0.0001, r > 0,988).

La discriminación visual (nivel de camuflaje) se evaluó según el modelo de discriminación de ruido de receptores de Vorobyev y Osorio, ampliamente utilizado24. Sobre la base de una reciente evaluación detallada de las estimaciones del ruido de los receptores59 , se seleccionó una fracción de Weber de 0,1 para la discriminación del color con proporciones de fotorreceptores de cono único (UV, onda corta, onda media, onda larga) de 1,00: 1,92: 2,68: 2,70, respectivamente60 , mientras que se utilizó una fracción de Weber de 0,2 para la luminancia. Para cuantificar la discriminación, se calcularon los valores JND tanto para el color como para el contraste acromático (luminancia). Los cálculos de JND para este último se basan en los conos dobles, y representan la capacidad de discriminación de dos espectros entre sí bajo el supuesto de que la discriminación visual está limitada por el ruido del receptor24,61. Se toma un valor de JND de 1,00 como umbral de discriminación para las aves, por lo que JND < 1,00 indica que dos objetos no pueden distinguirse incluso en condiciones óptimas de visión, y a medida que los valores aumentan > 1,00 esto denota un contraste creciente y mayores diferencias en la distinguibilidad62.

Creación de objetivos artificiales para los experimentos de depredación

Los objetivos artificiales de polillas para los experimentos de depredación aviar siguieron una amplia gama de experimentos pasados utilizando objetivos similares basados en fondos naturales o diseñados para imitar especies reales25,26,29,63. Los objetivos se crearon utilizando las imágenes multiespectrales generadas a partir de las fotografías de especímenes de museo de polillas. Al igual que en una serie de trabajos anteriores, las imágenes se convirtieron a las capturas de fotones previstas de la visión del herrerillo, en condiciones de iluminación D65, y luego se calibró la salida de una impresora en un proceso iterativo25,31,33 de manera que los colores de la imagen (valores de los píxeles) convergieran para coincidir con exactitud con las polillas reales en términos de visión de las aves al reproducirlas. La coincidencia para cada objetivo impreso fue un valor JND < 1,00, lo que indica la indistinguibilidad de una polilla real25,63. En general, la mayoría de los trabajos anteriores han tendido, por ejemplo, a hacer coincidir simplemente la apariencia de las alas del objetivo con el color medio (en capturas de fotones) del sustrato (por ejemplo, la corteza de un árbol26,64). Los trabajos anteriores en los que se han emparejado presas artificiales con modelos de lepidópteros también han tendido a asegurar que las coincidencias de color se basan en objetivos que caen dentro del rango de valores de captura de fotones del modelo animal real25. Nuestro trabajo sigue más de cerca otros trabajos recientes sobre la coloración de las mariposas63,65, que utilizaron un modelo de discriminación visual para crear coincidencias con las mariposas reales, con coincidencias elegidas cuando los colores caían dentro de 1-3 JNDs. Nuestro enfoque es, de hecho, aún más detallado en el sentido de que, a diferencia de los estudios anteriores, no creamos todos los objetivos por tratamiento como idénticos y simplemente coincidentes con una coloración media del modelo, sino que incluimos la variación individual haciendo coincidir diferentes objetivos individuales con 100 modelos únicos de polillas individuales (véase más adelante). Por lo tanto, nuestro trabajo es robusto al tener en cuenta tanto la variación individual como el establecimiento de criterios rigurosos, por lo que los modelos sólo se generaron cuando las coincidencias de color y luminancia con los especímenes reales estaban dentro de 1,00 JND.

Una vez que 50 individuos de cada uno de los dos morfos (n = 100) fueron calibrados correctamente, fueron escalados para asegurar que su tamaño se ajustaba con precisión a las polillas de la vida real; con cada ala, en promedio, 221 mm2 de superficie. Las muestras se imprimieron con una HP LaserJet Enterprise 500 Colour M551 en papel de filtro Whatman nº 1 de 12,5 cm pegado en papel normal A4. Se utilizó papel de filtro para imprimir los objetivos porque éste, a diferencia del papel de impresora normal, refleja la luz ultravioleta y nos permitió igualar la reflectancia UV de las polillas típicas, aunque la tinta de impresora es incapaz de imprimir la propia UV63. Las alas artificiales se hicieron a prueba de agua utilizando pintura acrílica transparente mate Plasti-Kote, que permitía la transmisión/reflexión de los rayos UV.

Se hizo un cuerpo comestible de pastelería, que se ha demostrado en varios experimentos anteriores que es una medida segura, comestible y eficaz de las tasas de depredación de las aves, incluso cuando se adjunta a los objetivos de papel27,66. Siguiendo protocolos anteriores, la manteca de cerdo y la harina común se mezclaron en una proporción de 1:3, antes de añadir cinco gotas de colorante alimentario negro para los morfos de carbonaria, o una combinación de aproximadamente una gota roja, una azul, tres amarillas y una(s) negra(s) para los morfos típicos. Se utilizó colorante alimentario blanco para añadir el dibujo a los cuerpos de las típicas. La masa se enrolló en forma de cuerpos de 12 × 5 × 2 mm, se fijó a las alas artificiales utilizando un alfiler de panel de 20 mm insertado en el centro del cuerpo de la masa, y se dejó toda la noche en el congelador para que se endureciera.

La creación de los cuerpos comestibles para los objetivos se vio un poco limitada tanto por los colorantes alimentarios disponibles como por el hecho de querer igualar tanto el color como la luminancia simultáneamente. Calculamos, utilizando los métodos anteriores y la modelización visual, los contrastes de color y luminancia de quince cuerpos de pastelería, de cada morfo, contra las propias polillas y los fondos naturales en reposo. Para la luminancia, los resultados de los cuerpos con respecto a las polillas fueron: carbonaria (media JND más error estándar: 3,838 ± 0,733) y typica (3,809 ± 0,731). Para el color, las coincidencias fueron: carbonaria (16,106 ± 1,477) y typica (4,991 ± 0,641). Las comparaciones de los cuerpos con los respectivos fondos naturales para la luminancia fueron: carbonaria (3,773 ± 0,348) y typica (1,660 ± 0,309). Para el color, las coincidencias fueron: carbonaria (13,721 ± 1,328) y typica (2,783 ± 0,148). Por lo tanto, los resultados demuestran una distinguibilidad relativamente baja de los cuerpos con respecto a las polillas y los fondos, con la excepción de la carbonaria para el color. Sin embargo, es muy poco probable que esta diferencia explique nuestros resultados de supervivencia por múltiples razones (ver Discusión).

Experimentos de depredación artificial

Se utilizaron objetivos de polillas artificiales modelados a los sistemas visuales de las aves como un proxy de las polillas de la pimienta para determinar la tasa de supervivencia de los morfos a través de un experimento de depredación de campo. Este enfoque está bien probado y sigue de cerca una serie de trabajos anteriores25,26,27,29,30,31,32,33,34,63,64,65. La recogida de datos se llevó a cabo en junio de 2017 para coincidir con la emergencia de la polilla de la pimienta entre mayo y agosto de 2017. Se seleccionaron diez lugares dentro de bosques caducifolios mixtos en zonas poco contaminadas del sur de Inglaterra en función de la disponibilidad de líquenes crustáceos. En Cornualles, estos fueron Argal Reservoir, Penryn (50°9′11ʺ N, 5°8′11ʺ W), Lady’s Wood, Truro (50°17′24.2ʺ N, 5°3′42.2ʺ W), St Clement Wood, Truro (50°17′29.2ʺ N, 5°3′16,1ʺ W), Kennall Vale, Ponsanooth (50°11′42,3ʺ N, 5°8′59,1ʺ W), y Devichoys Wood, Truro (50°15′17,5ʺ N, 5°3′23,6ʺ W). En Hampshire, se visitaron Holybourne Down, Alton (51°10′46,6ʺ N, 0°56′52,3ʺ W) y Chawton Park Wood, Alton (51°7′31,1ʺ N, 1°1′52,4ʺ W). El experimento siguió un diseño de bloques aleatorios26 de 500 muestras en diez bloques a lo largo de un transecto no lineal de entre 1 y 1,5 km de longitud. En cada bloque había 25 réplicas de cada tratamiento: 50 objetivos en total. Éstos se fijaron a una altura de 1,7 m en un árbol singular con líquenes, a una distancia mínima de 10 m entre sí. Si un árbol no tenía líquenes crustáceos a esta altura, se recorría 1 m más a lo largo del transecto hasta encontrar un árbol adecuado, y entonces el siguiente árbol se separaba 10 m. Las polillas se seleccionaron al azar de una bolsa, para evitar el sesgo de selección, y se fijaron con alfileres en los troncos y debajo de las ramas, ya que se ha demostrado que estas zonas son los lugares naturales de descanso más frecuentados por la polilla11. Los objetivos se fijaron con una orientación de 20° respecto al plano horizontal, ya que este es el comportamiento natural de las polillas geométricas41 (Fig. 3). Además, los objetivos se fijaron en el centro del parche de liquen que se estaba muestreando. Aunque puede haber un riesgo de sesgo inconsciente en este y otros experimentos similares anteriores, creemos que los procedimientos aquí utilizados lo hacen improbable. Cada transecto se controló en tres intervalos de tiempo: 6, 24 y 48 h. En cada intervalo, se visitaron todas las polillas para determinar si se había producido alguna depredación u otro resultado. Los resultados se censuraron con un 1 que representaba la depredación por parte de las aves o se censuró con un 0 si la polilla artificial había sobrevivido hasta las 48 h, si faltaba o si se había producido otro incidente, como la depredación por parte de una babosa (identificada por los rastros de baba26). La depredación por parte de las aves era evidente si el objetivo artificial tenía rasgaduras en el >50% del cuerpo19,46 y/o las alas estaban total o parcialmente retiradas. Como se ha señalado en estudios anteriores64, el proceso de registro de eventos de depredación con un número tan grande de objetivos es poco práctico, y de hecho experimentos como el nuestro aquí han sido validados en múltiples ocasiones. Otros estudios sobre presas artificiales también han deducido la depredación de las aves a partir de las marcas realizadas en los cuerpos de arcilla63. El bosque utilizado en este experimento es comparable al de otros estudios, en los que se incluyó información sobre las especies presentes y observadas como presas, entre ellas: herrerillos (Cyanistes caeruleus), herrerillos comunes (Parus major), petirrojos (Erithacus rubecula), pinzones (Fringilla coelebs), mirlos (Turdus merula) y gorriones comunes (Passer domesticus)32,64. Además, en estudios anteriores se han realizado observaciones directas de aves que atacan a polillas de la pimienta vivas y con alfileres6,11.

Análisis estadístico

Los análisis estadísticos de las imágenes se llevaron a cabo utilizando el software de libre acceso R (v.3.4.0)67. Se realizó un modelo lineal generalizado sobre las JND de color y luminancia, con el tipo de fondo como variable de respuesta y la morfología como variable explicativa. Se comprobó que los residuos del modelo cumplían los supuestos de homogeneidad de la varianza y de distribución normal, para lo cual los datos de JND de color, tanto para la corteza como para el liquen, requerían una transformación logarítmica para corregir la asimetría. Para el experimento de campo, se realizó un análisis no paramétrico de la distribución (censura derecha) utilizando el software estadístico Minitab 1868 con la estimación de Kaplan-Meier para medir las probabilidades de supervivencia, junto con la comparación de las curvas de supervivencia utilizando la prueba de rangos logarítmicos69,70 en el factor tratamiento. Se realizó un análisis no paramétrico porque los datos de supervivencia no suelen seguir una distribución determinada preestablecida. Todos los niveles de significación se fijaron en α = 0,05.

Disponibilidad de los datos

Los datos reportados en este trabajo están disponibles en los Datos Complementarios 1.