Amorce (biologie moléculaire)
Les amorces synthétiques sont des oligonucléotides synthétisés chimiquement, généralement d’ADN, qui peuvent être personnalisés pour s’hybrider à un site spécifique sur l’ADN matrice. En solution, l’amorce s’hybride spontanément avec la matrice par appariement de bases Watson-Crick avant d’être étendue par l’ADN polymérase. La possibilité de créer et de personnaliser des amorces synthétiques s’est avérée être un outil précieux nécessaire à une variété d’approches de biologie moléculaire impliquant l’analyse de l’ADN. La méthode de terminaison en chaîne Sanger et la méthode de séquençage de l’ADN » Next-Gen » nécessitent toutes deux des amorces pour initier la réaction.
Création d’amorces PCREdit
La réaction en chaîne par polymérase (PCR) utilise une paire d’amorces personnalisées pour diriger l’élongation de l’ADN l’une vers l’autre aux extrémités opposées de la séquence à amplifier. Ces amorces ont généralement une longueur de 18 à 24 bases et doivent coder uniquement pour les sites spécifiques en amont et en aval de la séquence à amplifier. Une amorce qui peut se lier à plusieurs régions le long de l’ADN les amplifiera toutes, éliminant le but de la PCR.
Quelques critères doivent être apportés en considération lors de la conception d’une paire d’amorces PCR. Les paires d’amorces doivent avoir des températures de fusion similaires puisque le recuit pendant la PCR se produit pour les deux brins simultanément, et cette température de fusion partagée ne doit être ni trop élevée ni trop basse par rapport à la température de recuit de la réaction. Une amorce dont la Tm (température de fusion) est trop élevée par rapport à la température d’annelage de la réaction peut mal s’hybrider et s’étendre à un endroit incorrect de la séquence d’ADN. Une Tm nettement inférieure à la température de recuit peut ne pas s’hybrider et s’étendre du tout.
En outre, les séquences d’amorce doivent être choisies pour sélectionner de manière unique une région d’ADN, en évitant la possibilité d’une hybridation avec une séquence similaire à proximité. Une méthode couramment utilisée pour sélectionner un site d’amorce est la recherche BLAST, qui permet de voir toutes les régions possibles auxquelles une amorce peut se lier. La séquence nucléotidique ainsi que l’amorce elle-même peuvent faire l’objet d’une recherche BLAST. L’outil gratuit Primer-BLAST du NCBI intègre la conception d’amorce et la recherche BLAST dans une seule application, tout comme les logiciels commerciaux tels que ePrime et Beacon Designer. Des simulations informatiques de résultats théoriques de PCR (Electronic PCR) peuvent être réalisées pour aider à la conception d’amorce en donnant les températures de fusion et d’annexion, etc.
De nombreux outils en ligne sont disponibles gratuitement pour la conception d’amorce, dont certains se concentrent sur des applications spécifiques de la PCR. Les outils populaires Primer3Plus et PrimerQuest peuvent être utilisés pour trouver des amorces correspondant à une grande variété de spécifications. Des amorces hautement dégénérées permettant de cibler une grande variété de matrices d’ADN peuvent être conçues de manière interactive à l’aide de GeneFISHER. Les amorces présentant une spécificité élevée pour un sous-ensemble de matrices d’ADN en présence de nombreuses variantes similaires peuvent être conçues à l’aide de DECIPHER. La conception des amorces vise à générer un équilibre entre la spécificité et l’efficacité de l’amplification.
La sélection d’une région spécifique de l’ADN pour la liaison des amorces nécessite quelques considérations supplémentaires. Les régions riches en répétitions mononucléotidiques et dinucléotidiques doivent être évitées, car la formation de boucles peut se produire et contribuer à une mauvaise hybridation. Les amorces ne doivent pas s’hybrider facilement avec d’autres amorces dans le mélange ; ce phénomène peut conduire à la production de produits « dimères d’amorces » contaminant la solution finale. Les amorces ne doivent pas non plus s’hybrider fortement à elles-mêmes, car les épingles à cheveux et les boucles internes pourraient entraver l’hybridation avec l’ADN matrice.
Lors de la conception des amorces, des bases nucléotidiques supplémentaires peuvent être ajoutées aux extrémités arrière de chaque amorce, ce qui entraîne une séquence de coiffe personnalisée à chaque extrémité de la région amplifiée. Une application de cette pratique est destinée au clonage TA, une technique spéciale de sous-clonage similaire à la PCR, où l’efficacité peut être augmentée en ajoutant des queues AG aux extrémités 5′ et 3′.
Amorces dégénéréesModifier
Certaines situations peuvent nécessiter l’utilisation d’amorces dégénérées. Il s’agit de mélanges d’amorces qui sont similaires, mais pas identiques. Elles peuvent être pratiques lors de l’amplification du même gène à partir de différents organismes, car les séquences sont probablement similaires mais pas identiques. Cette technique est utile car le code génétique lui-même est dégénéré, ce qui signifie que plusieurs codons différents peuvent coder pour le même acide aminé. Cela permet à différents organismes d’avoir une séquence génétique sensiblement différente qui code pour une protéine très similaire. Pour cette raison, les amorces dégénérées sont également utilisées lorsque la conception des amorces est basée sur la séquence des protéines, car la séquence spécifique des codons n’est pas connue. Ainsi, la séquence d’amorce correspondant à l’acide aminé isoleucine pourrait être « ATH », où A représente l’adénine, T la thymine et H l’adénine, la thymine ou la cytosine, selon le code génétique de chaque codon, en utilisant les symboles UICPA des bases dégénérées. Les amorces dégénérées peuvent ne pas s’hybrider parfaitement avec une séquence cible, ce qui peut réduire considérablement la spécificité de l’amplification par PCR.
Les amorces dégénérées sont largement utilisées et extrêmement utiles dans le domaine de l’écologie microbienne. Elles permettent l’amplification de gènes provenant de microorganismes jusqu’ici non cultivés ou permettent de récupérer des gènes d’organismes pour lesquels les informations génomiques ne sont pas disponibles. Habituellement, les amorces dégénérées sont conçues en alignant les séquences de gènes trouvées dans la GenBank. Les différences entre les séquences sont prises en compte en utilisant les dégénérescences UICPA pour les bases individuelles. Les amorces PCR sont ensuite synthétisées sous la forme d’un mélange d’amorces correspondant à toutes les permutations de la séquence de codons.