Le type de traitement de substitution rénale (hémodialyse versus dialyse péritonéale) n’affecte pas l’expression des gènes des cytokines ou les paramètres cliniques des candidats à la transplantation rénale

Abstract

Les patients atteints d’insuffisance rénale souffrent de perturbations immunitaires, causées par les toxines urémiques et influencées par le traitement par dialyse. L’objectif de la présente étude était de révéler si le type de modalité de dialyse (hémodialyse, HD, versus dialyse péritonéale, DP) affecte différentiellement l’immunocompétence, en particulier l’expression des gènes impliqués dans la réponse immunitaire. Matériel. 87 candidats à la transplantation rénale (66 HD, 21 PD) ont été inclus dans l’étude. Méthodes. Les échantillons d’ARN du sang périphérique ont été obtenus avec le système PAXgene Blood juste avant la transplantation. L’expression génétique de CASP3, FAS, TP53, FOXP3, IFNG, IL2, IL6, IL8, IL10, IL17, IL18, LCN2, TGFB1, et TNF a été évaluée par PCR en temps réel sur des réseaux basse densité conçus sur mesure (TaqMan). Les données d’expression génétique ont été analysées en relation avec les paramètres cliniques pré-transplantation. Résultats. L’expression moyenne des gènes examinés n’a montré aucune différence significative entre la DP et l’HD, à l’exception de FAS, dont l’expression était 30 % plus élevée chez les patients atteints de DP que dans le groupe HD. L’expression des cytokines pro-inflammatoires n’était pas significativement plus élevée dans le groupe PD. Les paramètres inflammatoires cliniques (CRP, taux d’albumine, de cholestérol et d’hémoglobine) ne différaient pas entre les groupes. Conclusion. Le type de traitement de substitution rénale n’exerce aucun effet différentiel sur l’expression génétique des cytokines ou sur les paramètres cliniques inflammatoires.

1. Introduction

L’insuffisance rénale terminale (IRT) est connue pour être un état d’incompétence immunitaire, qui se traduit par diverses anomalies immunitaires. Une microinflammation systémique et locale accompagnée d’une déficience immunitaire est observée chez les patients atteints d’urémie. Une réactivité inadéquate à la vaccination, par exemple contre l’hépatite B, a été décrite chez les patients atteints d’IRT . Ces patients sont également plus sensibles aux infections virales et bactériennes, qui constituent la deuxième cause (après les maladies cardiovasculaires) de mortalité pendant le traitement de substitution rénale. L’influence de la malnutrition et des cytokines inflammatoires sur le risque cardiovasculaire, les infections et le taux de mortalité a été largement étudiée. L’urémie et l’hyperparathyroïdie secondaire sont connues depuis les années 1990 pour avoir un impact sur la fonction des lymphocytes B et T et la production d’anticorps .

Récemment, on a signalé que l’urémie influençait la synthèse des cytokines . Ce phénomène s’explique en partie par la déficience en neutrophiles, ainsi que par les modifications de la fonction neutrophile dans l’IRT . L’inflammation chronique peut être détectée par des taux sanguins élevés de protéine C-réactive (CRP) et de certaines cytokines, par exemple IL-6, IL-18, IL-10 et TNF-alpha . On a également signalé une fonction anormale des cellules T régulatrices dans l’urémie et un déséquilibre des cellules B immatures et à mémoire .

Les anomalies décrites ci-dessus sont encore renforcées par le traitement de substitution rénale. L’activation de la voie Th2 avec un effet tolérogène potentiel a été observée pendant l’hémodialyse . De plus, la dialyse péritonéale (notamment avec des liquides péritonéaux tamponnés au lactate) a exercé des effets délétères sur les sous-ensembles de cellules Th1 et a favorisé la réponse immunitaire de type Th2 . En revanche, certains auteurs n’ont rapporté aucune influence de la thérapie de remplacement rénal sur les niveaux de cytokines et de CRP sérique .

Alors que les défauts immunitaires sont bien décrits dans la littérature, il n’est toujours pas clair si le type de modalité de dialyse (hémodialyse versus dialyse péritonéale) affecte différentiellement l’immunocompétence, en particulier l’expression des gènes impliqués dans la réponse immunitaire et l’inflammation avec le changement des profils de gènes inflammatoires chez les patients en liste d’attente active de transplantation. L’objectif de cette étude était d’étudier l’expression des gènes liés aux cytokines et à l’apoptose dans le sang avant la transplantation afin de révéler une éventuelle différence chez les patients sous hémodialyse (HD) et dialyse péritonéale (DP) en relation avec les indices cliniques de malnutrition ainsi que les processus inflammatoires.

Nous nous sommes concentrés sur les facteurs immunitaires connus pour être liés aux lésions tissulaires et à l’inflammation (IL-6, IL-8, IL-17, IL-18, NGAL et TNF-alpha), à l’apoptose (Fas, caspase-3 et p53) et à l’activation des lymphocytes Th1 (IFN-gamma, IL-2), ainsi qu’aux Th2 (IL-10, TGF-beta1) et à la fonction des cellules T régulatrices (FoxP3).

2. matériel

L’étude a été réalisée sur 87 candidats à la transplantation rénale (âgés de 16 à 72 ans, moyenne 47 ans ; 34 femmes, 53 hommes) qui avaient été admis à l’hôpital pour une chirurgie de transplantation. Parmi eux, 66 patients ont été traités par hémodialyse et 21 patients par dialyse péritonéale. Les caractéristiques des patients sont présentées dans le tableau 1.

Tous les patients HD ont été traités par hémodialyse à faible flux sur des dialyseurs à membrane en polysulfone avec des solutions contenant du bicarbonate pendant 4 h trois fois par semaine.

Tous les patients du groupe PD étaient en dialyse péritonéale continue ambulatoire. Les solutions standard d’un volume de 2 l avec différentes concentrations de glucose (principalement 3 fois avec 1,36/1,5%, et une fois avec 2,3%) ont été utilisées. Aucune solution contenant de l’icodextrine ou des acides aminés n’a été utilisée.

Le Kt/V hebdomadaire > 1,7 a été rapporté chez tous les patients PD. Dans le groupe HD, le Kt/V par séance en pool unique de tous les sujets était >1,2. Les patients sont restés sous traitement de substitution rénale de 1 à 97 mois (moyenne 25 ± 18 mois).

Les échantillons de sang pour les tests de laboratoire de routine ainsi que l’expression des gènes ont été prélevés lors de l’examen immédiat avant la transplantation, avant l’introduction du traitement immunosuppresseur. Les échantillons ont été obtenus au moins 6 heures après la dernière séance de HD ou au moins 4 heures après le dernier prélèvement de liquide péritonéal.

Les données cliniques ont été obtenues à partir des dossiers médicaux des centres de dialyse des patients.

Le projet a été réalisé après approbation de la Commission de bioéthique de l’Université de médecine de Wroclaw, et tous les aspects de l’étude étaient conformes à la Déclaration d’Helsinki de l’Association médicale mondiale. Chaque patient a lu une fiche d’information et a fourni un consentement pleinement éclairé.

3. Méthodes

Les échantillons de sang périphérique ont été obtenus avec des tubes PAXgene Blood RNA. L’ARN a été isolé avec un kit PAXgene Blood RNA (PreAnalytics) et transcrit de manière inverse avec un kit High Capacity RNA to cDNA (Applied Biosystems). L’expression génétique dans le sang périphérique de la caspase-3 (CASP3, Hs00263337_m1), FAS (FAS, Hs00236330_m1), p53 (TP53, Hs00153349_m1), FOXP3 (FOXP3, Hs00203958_m1), IFN-gamma (IFNG, Hs00174143_m1), interleukine-2 (IL2, Hs00174114_m1), interleukine-6 (IL6, Hs00174131_m1), interleukine-8 (IL8, Hs00174103_m1), interleukine-10 (IL10, Hs00174086_m1), interleukine-17 (IL17A, Hs99999082_m1), interleukine-18 (IL18, Hs00155517_m1), NGAL (LCN2, Hs00194353_m1), TGF-beta (TGFB1, Hs99999918_m1), et TNF-alpha (TNF, Hs00174128_m1) a été évalué par PCR en temps réel sur des réseaux basse densité conçus sur mesure (TaqMan) avec le mélange maître TaqMan PCR. Toutes les procédures ont été effectuées selon les protocoles du fabricant. La GAPDH (Hs99999905_m1) a été choisie comme gène de référence et s’est avérée invariante entre les groupes étudiés.

Les données d’expression sont présentées comme ΔΔCt = ΔCtHD – ΔCtsample, où ΔCtHD est la valeur moyenne de ΔCtsample pour le groupe HD, ΔCtsample = Ctgene – CtGAPDH, et Ct est la valeur seuil du cycle et définit le nombre de cycles calculés, au cours desquels la fluorescence mesurée pendant la réaction PCR augmente au-delà de la valeur seuil prédéfinie. L’équation susmentionnée fournit des données d’expression liées à la fois au gène de référence GAPDH et au niveau d’expression moyen pour le HD, qui est considéré ici comme un groupe de référence. Le changement relatif de l’expression observée de la MP par rapport à la HD est calculé comme pour le ΔΔCt moyen de la MP.

3.1. Analyse statistique

L’analyse statistique a été réalisée à l’aide du progiciel statistique Statistica v.10 (StatSoft, Pologne). Le test du chi-deux a été utilisé pour évaluer la différence de proportions entre deux groupes. L’hypothèse de normalité a été testée pour chaque variable continue. La différence entre les deux groupes a été évaluée avec un -test ou, en cas d’absence de normalité, elle a été analysée avec le -test de Mann-Whitney. Les corrélations ont été testées avec la corrélation de Pearson ou la corrélation de Spearman, respectivement. a été considérée comme significative.

4. Résultats

4.1. Paramètres cliniques

Les groupes de patients ne différaient pas significativement selon l’âge, le sexe ou la répartition de l’IMC. La durée du traitement de substitution rénale était significativement plus courte dans le groupe DP par rapport au groupe HD (médiane : 15 versus 24,5 mois, resp.).

Les paramètres sanguins cliniques prétransplantation sont présentés dans le tableau 2. Les paramètres cliniques inflammatoires (CRP, taux d’albumine, de cholestérol et d’hémoglobine) et la créatinine sérique ainsi que le taux de fer avec saturation de la transferrine et l’iPTH ne différaient pas entre les groupes. Seule la concentration sérique d’acide urique avant la transplantation était significativement plus élevée dans le groupe PD (médiane : 4,9 contre 6,5 mg/dL). L’âge du patient et les niveaux de CRP étaient plus faibles dans le groupe PD, mais les différences n’ont pas atteint la signification statistique.

4.2. Expression des gènes

Les niveaux d’expression moyens des gènes sont présentés dans le tableau 3. L’expression du gène IL17 était indétectable chez tous les patients.

L’expression sérique moyenne des gènes n’a montré aucune différence significative entre la MP et la HD, à l’exception de FAS, dont l’expression était 1,29 fois plus élevée (IC 95 % 1,03-1.61) chez les patients atteints de MP par rapport au groupe HD (figure 1).

Figure 1

ΔΔCt décrivant l’expression génique relative de FAS par rapport à GAPDH dans le groupe dialyse péritonéale (DP) et hémodialyse (HD), rapporté à la moyenne des échantillons HD. Graphique présenté sous forme de carré : moyenne, boîte : moyenne ± SE, et moustaches : IC 95 %.

Bien qu’une expression génétique plus élevée des cytokines pro-inflammatoires (IFNG, IL6 et IL18) dans le groupe PD ait été notée, les différences n’étaient pas statistiquement significatives. De même, l’expression génique plus faible de l’IL10 et plus élevée du TGFB1 observée dans le groupe PD n’était pas statistiquement significative.

Nous avons constaté une expression relative significativement plus faible (0,68x, IC 95 % 0,50-0,93) de l’IL10 par rapport au SAF dans le groupe PD par rapport au groupe HD (-test, ). Nous avons également observé une expression relative plus faible (0,74x, IC à 95 %, 0,55-1,01) de l’IL10 par rapport à l’IL18, ce qui est à la limite de l’importance (-test, ). L’expression relative plus faible (0,60x, IC 95 % 0,35-1,04) de l’IL10 par rapport à l’IFNG dans le groupe PD par rapport au groupe HD n’a pas atteint la signification statistique (-test, ).

L’expression de certains gènes était liée aux paramètres cliniques des patients. Les corrélations sont présentées dans le tableau 4. La durée du traitement de substitution rénale n’a pas influencé l’expression d’aucun des gènes examinés.

L’expression deFOXP3 était négativement corrélée avec le WBC dans les deux groupes (, , et ), accompagnée de IL2 et IL6 (, , et , respectivement). L’expression du gène IL10 était significativement corrélée au taux d’albumine (, ). L’expression du gène LCN2 (NGAL) était positivement corrélée avec le nombre de globules blancs (, ). De même, l’IMC était positivement corrélé à l’expression du gène LCN2 (, ) (figure 2).

Figure 2

ΔΔCt décrivant l’expression génique relative de LCN2 (NGAL) en fonction de l’IMC.

5. Discussion

L’insuffisance rénale terminale (IRT) est associée à la fois à une inflammation et à une déficience immunitaire . Dans notre étude, nous nous sommes concentrés sur le large éventail de facteurs immunitaires connus pour être liés à l’inflammation, l’apoptose et l’activation des lymphocytes Th1 et Th2, ainsi que la fonction des cellules T régulatrices. Il convient de souligner que l’étude a porté sur des patients HD et PD relativement sains juste avant la transplantation. Le bien-être général des patients leur permettait d’être qualifiés pour une transplantation rénale et ne différait pas en termes d’indicateurs cliniques, à l’exception de la période de dialyse plus courte dans le groupe PD. Dans ce groupe sélectionné, les principaux résultats de notre étude sont les suivants : les symptômes cliniques d’inflammation chronique en général ne différencient pas le groupe PD du groupe HD. De même, l’expression des gènes pro- et anti-inflammatoires était similaire dans les deux groupes examinés. Un type uniforme de schéma d’activation Th1 et Th2 a été observé dans les deux groupes.

Seul un taux d’apoptose intensifié avec une augmentation de l’expression du gène FAS a été observé chez les patients PD par rapport aux patients HD. Une expression relative plus faible de l’IL10 par rapport aux cytokines pro-inflammatoires (IL18, IL10, IL6 et IFNG) dans le groupe PD par rapport au groupe HD a également été observée. La durée de la thérapie de remplacement rénal était le seul paramètre clinique qui différenciait le groupe HD du groupe PD. Néanmoins, la durée de la thérapie de remplacement rénal n’a pas influencé l’expression de l’un des gènes examinés. Par conséquent, l’upregulation observée du gène FAS semble être attribuable uniquement au type de dialyse.

Une déficience et un dysfonctionnement des neutrophiles dus non seulement aux toxines urémiques mais aussi au syndrome malnutrition-inflammation-athérosclérose (MIA) et à la dialyse ont été rapportés . L’inflammation chronique avec accélération de l’athéromatose est responsable du taux élevé de morbidité et de mortalité chez les patients dialysés. Les lymphocytes T-helper étaient polarisés vers le phénotype Th2 avec une synthèse plus élevée d’IL-4 et d’IL-10 chez les patients urémiques et une libération plus faible d’IFN-gamma . Ces rapports suggèrent que l’urémie est associée à une prédominance des cellules Th2 et à un changement de la synthèse des cytokines vers une immunité à médiation cellulaire déprimée. Dans notre étude, nous avons observé le schéma universel d’activation immunitaire chez les patients en liste d’attente active, sans commutation vers une réponse Th1 ou Th2.

Des Tregs suractivés mais fonctionnellement compromis ont été décrits dans l’IRT. Les niveaux basaux d’ARNm de l’IL2 et du FOXP3 étaient élevés mais ne s’élevaient pas lors de la stimulation . Un déséquilibre de la fonction Treg/Th17 par rapport aux contrôles sains a été décrit dans le groupe ESRD. Dans notre étude, l’expression du gène IL17 était indétectable chez tous les patients, il a donc été exclu de l’analyse ultérieure.

Les indices de laboratoire de la micro-inflammation comprennent des niveaux sanguins élevés de CRP et de certaines cytokines, principalement IL-6, IL-18, IL-10 et TNF-alpha, qui sont corrélés à l’accélération de l’athérosclérose . L’hypoalbuminémie est un facteur de risque de septicémie chez les patients dialysés. La malnutrition peut être causée par une inflammation chronique via des niveaux accrus de cytokines pro-inflammatoires. Aucune malnutrition manifeste n’a été observée chez les patients de notre étude. La cohorte de l’étude était composée de patients en liste d’attente active, constituant ainsi un groupe sélectionné de patients sous TRR, en meilleure santé que la moyenne de la population dialysée. De plus, les taux d’albumine détectés étaient dans les limites de la normale pour la majorité des patients. Nous avons observé une corrélation significative entre le taux d’albumine et l’expression du gène IL10 chez tous les patients et dans le groupe HD. C’est un résultat attendu car l’hypoalbuminémie a été décrite comme un facteur puissant d’augmentation de l’inflammation chronique. Les mécanismes anti-inflammatoires de l’IL-10 ont été signalés comme limitant la production d’un large éventail de facteurs pro-inflammatoires. Dans notre étude, nous avons également observé que l’expression relative du gène anti-inflammatoire IL10 par rapport aux gènes pro-inflammatoires IL6, IFNG et IL18 était plus faible dans le groupe PD que dans le groupe HD. Ce fait peut indiquer l’intensification du processus inflammatoire dans le groupe PD.

L’activation chronique du système immunitaire peut être encore intensifiée par la thérapie de remplacement rénal. Plusieurs études ont été réalisées pour élucider si le type de technique de dialyse peut influencer l’induction d’un état inflammatoire chronique.

L’utilisation de différents fluides péritonéaux était associée à un équilibre Th1/Th2 perturbé. L’utilisation de liquide péritonéal tamponné au lactate a des effets délétères sur les cellules Th1 par rapport à la solution d’icodextrine et à la solution tamponnée au lactate/bicarbonate . Au contraire, aucune influence de la biocompatibilité des solutions de DP sur un quelconque paramètre du syndrome MIA n’a été rapportée. Hwang et al. ont rapporté que le polymorphisme du gène IL6 influençait le taux de transport de soluté péritonéal chez les patients PD .

Des rapports opposés d’aucune influence du traitement de remplacement rénal sur les niveaux de cytokine et de CRP sérique ont été publiés . Dans notre étude, le niveau de CRP était négativement corrélé avec l’expression du gène TNF uniquement dans le groupe PD. Les macrophages activés sont la principale origine cellulaire du TNF-alpha. Les rapports précédents sur l’association entre les niveaux de CRP et l’expression du TNF-alpha étaient incohérents, ce qui indique que la présence de TNF-alpha dans le sang dépend d’une relation complexe dans la réponse inflammatoire et peut ne pas refléter l’activité biologique au niveau des tissus. Dans notre étude, presque tous les patients du groupe HD ont été examinés plus de 6 heures après l’hémodialyse, de sorte que l’effet de la session unique d’hémodialyse sur l’expression des gènes n’a pas été pris en compte.

Une augmentation de l’apoptose des leucocytes associée à une augmentation des niveaux de protéines sériques Fas et p53 ainsi qu’à une diminution de l’expression du gène antiapoptotique bcl-2 des neutrophiles a été décrite chez les patients atteints d’IRT . Dans notre étude, nous avons constaté que l’expression du FAS proapoptotique était significativement plus élevée chez les patients atteints de la maladie de Parkinson que chez les patients atteints de la maladie de Huntington. De plus, l’expression du gène proapoptotique TP53 était corrélée négativement avec le nombre de globules blancs. La signification clinique de cette observation reste incertaine, au-delà d’une spéculation sur un état cellulaire immunitaire et inflammatoire plus équilibré chez les candidats à la transplantation de la MP. De plus, cette observation soutient l’hypothèse selon laquelle l’augmentation de l’apoptose des neutrophiles influence le WBC total chez les patients urémiques.

Nous avons également constaté que l’expression du gène NGAL (LCN2) était positivement corrélée au WBC chez tous les patients et dans le groupe HD. NGAL est une protéine libérée principalement par les neutrophiles, mais aussi les cellules tubulaires rénales et certaines cellules extrarénales, en particulier les adipocytes , et dépend fortement de leur nombre absolu, donc la corrélation positive avec le WBC n’est pas surprenante et confirme d’autres rapports . En outre, nous avons trouvé une forte corrélation de l’expression du gène NGAL avec l’IMC, ce qui est en accord avec les rapports d’autres auteurs et soutient l’observation que NGAL est étroitement associé à l’obésité.

6. Limites de l’étude

Bien qu’il s’agisse, à notre connaissance, du premier rapport publié qui compare directement l’expression des gènes liés aux cytokines et à l’apoptose entre les patients HD et PD dans la période de pré-transplantation, certaines limites potentielles doivent être mentionnées.

Nous avons analysé les données de plus de patients traités par HD que par PD. La disparité entre le nombre de patients traités par ces deux modalités de dialyse reflète la situation globale de la thérapie de remplacement rénal. Moins de 5 % des patients atteints d’insuffisance rénale terminale sont traités par DP en Pologne, ce qui est similaire à la situation mondiale où moins de 11 % des patients sont traités par DP.

Cette étude était basée sur une évaluation en un seul point temporel de l’expression des cytokines inflammatoires et des coefficients cliniques. Nous n’avions pas la possibilité d’évaluer les changements dépendants du temps dans les expressions génétiques des cytokines. Le concept a été choisi sur la base du fait que les patients éligibles pour une transplantation ne souffrent actuellement d’aucune infection aiguë. Ils présentent généralement un très bon état clinique avec une efficacité de dialyse élevée. Tous les patients au moment de la transplantation étaient cliniquement stables, sans signe d’inflammation, sans antécédents de cancer, de maladies inflammatoires ou de traitement immunosuppresseur. Nos résultats ont été obtenus pour un groupe relativement homogène de receveurs potentiels sur une liste d’attente active, qui ne sont pas représentatifs de tous les patients sous traitement de substitution rénale.

7. Conclusion

Le type de traitement de substitution rénale n’exerce aucun effet différentiel sur l’expression génique des cytokines ou les paramètres cliniques inflammatoires, à l’exception d’un taux d’apoptose accru avec une expression génique FAS plus importante chez les patients PD par rapport aux patients HD. De plus, l’expression du gène IL10, un anti-inflammatoire associé aux cytokines pro-inflammatoires, était plus faible dans le groupe PD. Il est possible que l’urémie soit le facteur le plus puissant qui déclenche l’activation immunitaire et que les autres changements induits par les différents types de traitement de substitution rénale soient trop subtils pour être apparents. L’intensité de la réponse inflammatoire, mesurée par l’expression des gènes des cytokines, peut encore influencer la réponse allo-immune post-transplantation et la survie du greffon.

Abréviations

Conflit d’intérêts

Les auteurs déclarent qu’il n’y a aucun conflit d’intérêts concernant la publication de cet article.

Reconnaissance

Cette étude a été soutenue par une subvention de recherche de la Société polonaise de néphrologie financée par Baxter.