Tout sur l’agar
Une introduction à l’agar
Avec son odeur distinctive, on peut facilement distinguer l’agar des autres matériaux que l’on trouve couramment dans un laboratoire. Chimiquement, l’agar est un polymère composé de sous-unités du sucre galactose, et est un composant des parois cellulaires de plusieurs espèces d’algues rouges qui sont généralement récoltées en Asie orientale et en Californie. Dissous dans de l’eau bouillante et refroidi, l’agar de laboratoire prend un aspect gélatineux. Bien que l’agar soit principalement utilisé comme milieu de culture pour divers micro-organismes, en particulier pour les bactéries, ses autres utilisations moins connues consistent à servir d’épaississant pour les soupes et les sauces, dans les gelées et les glaces, dans les cosmétiques, pour clarifier les boissons et pour dimensionner les tissus.(1)
On pourrait se demander pourquoi l’agar, par opposition à la gélatine ordinaire (comme celle que l’on trouve dans le Jello), est utilisé pour la culture des bactéries. La réponse est que l’agar, contrairement à la gélatine, ne sera pas dégradé (mangé) par les bactéries. De plus, l’agar est plus ferme et plus résistant que la gélatine. Il est cependant toujours possible d’utiliser la gélatine comme milieu de culture pour les bactéries si l’agar n’est pas disponible.(2)
Le manuel Difco & BBL donne plus de détails sur l’agar et son utilisation :(3)
L’agar est un phycocolloïde extrait d’un groupe d’algues marines rouge-pourpre (classe des Rhodophycées), notamment Gelidium, Pterocladia et Gracilaria. Le gelidium est la source préférée des agars. Les impuretés, les débris, les minéraux et les pigments sont réduits à des niveaux spécifiés pendant la fabrication.
L’agar est un gel à température ambiante, restant ferme à une température aussi élevée que 65°C. L’agar fond à environ 85°C, une température différente de celle à laquelle il se solidifie, 32-40°C. Cette propriété est connue sous le nom d’hystérésis. L’agar est généralement résistant aux forces de cisaillement ; cependant, différents agars peuvent avoir des forces de gel ou des degrés de rigidité différents.
L’agar est généralement utilisé à une concentration finale de 1 à 2 % pour solidifier les milieux de culture. Des quantités plus faibles (0,05-0,5%) sont utilisées dans les milieux pour les études de motilité (0,5% p/v) et pour la croissance des anaérobies (0,1%) et des microaérophiles.
Les spécifications de la gélose de qualité bactériologique comprennent une bonne clarté, une température de gélification contrôlée, une température de fusion contrôlée, de bonnes caractéristiques de diffusion, l’absence d’inhibiteurs bactériens toxiques et une absence relative de minéraux et de composés métaboliquement utiles.
La meilleure gélose pour les projets d’étudiants
Pour les étudiants qui cultivent des bactéries à la maison sans la supervision d’un enseignant (par exemple, en étudiant la croissance des bactéries à divers endroits de la maison), il est important d’utiliser une formulation de gélose qui ne cultive pas préférentiellement un type de bactéries par rapport à un autre. Le pire des cas serait une gélose qui favoriserait la croissance des bactéries pathogènes. Nous recommandons donc une gélose nutritive ordinaire. Des boîtes de Pétri prêtes à l’emploi contenant de la gélose nutritive peuvent être achetées directement auprès de Carolina Biological.
Types courants de gélose
Différents types de gélose sont utilisés pour la culture de différentes souches de bactéries. Généralement, une procédure expérimentale vous indiquera le type de gélose à utiliser. Si vous n’êtes toujours pas sûr, demandez à un enseignant ou consultez notre forum Demandez à un expert. Tous les types de gélose ne peuvent pas être utilisés par les élèves sans surveillance à la maison. La liste suivante vous donnera un aperçu de quelques-uns des types de gélose que l’on trouve couramment dans les laboratoires. Beaucoup d’entre elles peuvent être achetées chez Carolina Biological.
| Type de gélose | Description succincte | Spécifique à l’usage des étudiants ? |
|---|---|---|
| Gélose au sang | Contenant des cellules sanguines d’un animal (par exemple un mouton) ; la plupart des bactéries se développeront sur ce milieu. | Non, en raison du potentiel de contamination par contact humain. |
| Gélose chocolat | Composée de sang de mouton qui fournit les facteurs X et V nécessaires à la croissance des Haemophilus, c’est un milieu nutritif qui est utilisé dans la culture d’organismes fastidieux tels que les espèces Haemophilus et Neisseria. La gélose chocolat, cependant, ne révèle pas les données d’hémolyse, de sorte que la différenciation des espèces parmi les membres d’Haemophilus doit être effectuée d’une autre manière. | Non, en raison du potentiel de contamination par contact humain. |
| Gélose LB (Luria Bertani) | Un sous-type de gélose nutritive, c’est le milieu général pour les études de microbiologie et peut être utilisé pour la culture de routine de micro-organismes pas particulièrement fastidieux. De plus, elle ne cultive pas préférentiellement un type de bactéries par rapport à un autre. | Oui. |
| Gélose MacConkey | C’est une gélose sur laquelle seules les bactéries à Gram négatif peuvent se développer. De plus, les E.coli se développeront en colonies rouges, car un indicateur de pH est présent. Il convient de préciser que la poudre de gélose MacConkey existe en deux versions : l’une contient du lactose, un sucre, et l’autre ne contient aucun sucre ajouté. Comme E.coli transforme les sucres en acides (d’où la couleur rouge), on peut ajouter l’un des nombreux types de sucres à cette gélose MacConkey sans sucre et voir si des colonies rouges se développent. Si vous obtenez des colonies rouges, vous savez que la souche d’E.coli que vous utilisez peut utiliser ce sucre. | Non, en raison de la sélectivité. |
| Miller’s LB Agar | Cette variante courante de la gélose LB semble avoir les mêmes composants que la LB, juste dans des proportions différentes. | Oui, mais il est recommandé de s’en tenir à la formule générique. |
| Gélose de néomycine | Contenant l’antibiotique néomycine, que l’on retrouve dans de nombreux médicaments tels que les crèmes, les pommades et les gouttes oculaires. La néomycine a été découverte en 1949 par le microbiologiste Selman Waksman, et elle est produite naturellement par la bactérie Streptomyces fradiae. De plus, la néomycine a un large spectre d’effets, tuant à la fois les bactéries gram-positives et gram-négatives. Elle est relativement toxique pour l’homme et certaines personnes ont des réactions allergiques à cette substance. La gélose à la néomycine est souvent utilisée pour la culture d’organismes en anaérobiose. La néomycine arrête la croissance des bacilles à Gram négatif et des staphylocoques, ce qui permet aux espèces de Streptococcus de se développer plus abondamment. | Non, en raison de problèmes de sécurité. |
| Gar non nutritive | En général, elle ne convient pas à la culture des bactéries. Cependant, elle peut être utilisée pour la culture d’autres micro-organismes. | Non. |
| Gélose nutritive | Pourra faire pousser le plus grand nombre de types de microbes différents – champignons et bactéries. Pourtant, toutes les bactéries ne peuvent pas s’y développer. Certaines la trouvent trop riche, d’autres la trouvent déficiente. Le nutriment qui s’y trouve est le bouillon de bœuf, et certains extraits de levure. | Oui. |
| Sabouraud Agar | Utilisé pour les champignons et a un pH bas qui tuera la plupart des bactéries. Elle contient de la gentamicine, qui est un antibiotique de type aminoglycoside. La gentamicine peut également traiter de nombreux types d’infections bactériennes, en particulier l’infection à Gram négatif. | Non, en raison de problèmes de sécurité. |
| Garine de Thayer-Martin | Gar au chocolat conçue pour isoler la Neisseria gonorrhoeae, également connue sous le nom de « gonocoque », qui est une espèce de bactérie à Gram négatif responsable de la maladie de la gonorrhée. | Non, en raison du risque de contamination par contact humain. |
| Gélose tryptique de soja | Un milieu de base utilisé pour la culture de nombreux types de micro-organismes. La gélose tryptique de soja est principalement utilisée comme milieu de croissance initial aux fins suivantes : observation de la morphologie des colonies, développement d’une culture pure, obtention d’une croissance suffisante pour des tests biochimiques ultérieurs et stockage des cultures. | Oui. |
| Gélose XLD | Gélose au xylose lysine désoxycholate. Elle est utilisée pour la culture d’échantillons de selles, et contient deux indicateurs. Elle est formulée pour inhiber les bactéries à Gram positif, tandis que la croissance des bacilles à Gram négatif est encouragée. Les colonies des fermenteurs du lactose apparaissent en jaune. | Non, en raison de la sélectivité. |
Préparation de la gélose en bouteille et des plaques(5)
Pré-expérimentation:
Gardez les boîtes de Pétri stériles fermées jusqu’à ce que vous soyez prêt à y verser la gélose. Les contaminants transportés par l’air peuvent facilement envahir une boîte de Pétri ouverte.
Bien que des plaques de gélose pré-coulées soient disponibles, on peut fabriquer des plaques de gélose à partir de gélose en comprimé, en poudre ou en bouteille en suivant quelques instructions simples. Les kits de gélose sont généralement accompagnés d’instructions détaillées sur la façon de préparer les plaques, et vous trouverez ci-dessous des exemples de procédures à titre de référence. En cas de doute, veillez à bien lire les instructions et à demander de l’aide si nécessaire (consultez un professeur ou appelez la ligne d’assistance technique du fournisseur du kit de gélose).
Préparation de la gélose en comprimé ou en poudre :
La formulation de la gélose LB (Luria Bertani) est la suivante : 9,1 g/L de tryptone, 4,6 g/L d’extrait de levure, 4,6 g/L de NaCl et 13,7 g/L de gélose. Si vous utilisez des comprimés, dissolvez 10 comprimés dans 500 ml d’eau. Pour les poudres d’agar, dissoudre au micro-ondes, 6,9 g d’agar dans 500 ml d’eau. 500 ml de gélose permettront de verser ~ 25 grandes boîtes de Pétri (100 mm de diamètre) ou 50 petites boîtes de Pétri (60 mm de diamètre).
Préparation de la gélose en bouteille :
- Détacher le bouchon de la bouteille, mais ne pas retirer le bouchon pendant le chauffage.
- Réchauffer la bouteille d’agar au bain-marie ou au micro-ondes jusqu’à ce qu’elle devienne liquide.
- Après avoir ouvert le bouchon, passez le goulot de la bouteille d’agar à travers une flamme pour la stériliser. Ne perdez pas le bouchon !
- Tout en versant l’agar, ouvrez le couvercle de la boîte de Pétri le moins possible, tenez-le en biais et assurez-vous que le couvercle est maintenu directement au-dessus de la boîte de Pétri.
- Versez suffisamment de gélose fondue dans chaque boîte de Pétri en plastique stérile pour couvrir 1/8″ du fond. Couvrez immédiatement le couvercle de la boîte de Pétri.
- Placer les plaques de gélose sur un comptoir pour qu’elles refroidissent et prennent. Le milieu gélosé durcira comme de la gélatine rigide à température ambiante.
- Passer le goulot de la bouteille d’agar à travers la flamme à nouveau avant d’appliquer le bouchon.
Préparation des plaques pré-coulées :
Si les plaques ont été réfrigérées, les sortir et les laisser se réchauffer à température ambiante.
Entreposage:
Entreposer les plaques de gélose à l’envers dans le réfrigérateur. Ne pas congeler ! Le but de placer les plaques à l’envers est d’empêcher la condensation de s’écouler sur la surface de la gélose, ce qui pourrait alors faciliter le déplacement des organismes entre les colonies.
Voir http://www.umsl.edu/~microbes/pdf/tipsforplates.pdf pour des conseils supplémentaires.
Préoccupations supplémentaires en matière de sécurité(6)
- Lorsque l’on agite la solution de bouillon, il faut veiller tout particulièrement à commencer l’échelle d’agitation à un réglage bas et à augmenter la vitesse à partir de là.
- Lorsque l’on chauffe le bouillon, il faut s’assurer de couvrir le flacon de manière à ne pas se prêter à l’ébullition, mais à éviter les débordements.
- Lorsque vous versez le bouillon, veillez à remplir la boîte de Pétri sans vous brûler. En outre, il est important dans ce processus de s’assurer que la boîte de Pétri est couverte immédiatement pour permettre à la substance de refroidir proportionnellement.
- Une fois que les boîtes de Pétri ont été exposées ou inoculées, les élèves ne doivent pas les rouvrir.
Incubation(7)
Placez chaque boîte de Pétri à l’intérieur d’un sac à fermeture éclair pour éviter le dessèchement et pour contrôler les odeurs. Retournez les plaques et mettez-les dans un endroit chaud. Pour de nombreux micro-organismes, la température idéale d’incubation est de 32°C ou 90°F. La croissance bactérienne devrait commencer à devenir visible au bout de 2 à 3 jours.
Pour ceux qui cultivent des bactéries à la maison (par exemple, pour étudier la croissance des bactéries à divers endroits de la maison), vous pouvez utiliser un « incubateur à ampoule » fait maison à la place d’un incubateur de laboratoire. Cette page décrit comment construire un « incubateur à ampoule » : » http://www.umsl.edu/~microbes/pdf/Incubator.pdf
Élimination(8)
Une fois que les boîtes de Pétri ont été fermées avec du ruban adhésif, elles ne doivent plus être ouvertes. Tous les micro-organismes cultivés pendant l’expérience doivent être tués avant d’être jetés. La meilleure façon d’éliminer les cultures bactériennes est de les stériliser sous pression dans un sac à risque biologique stable à la chaleur. Si les autoclaves ou les autocuiseurs ne sont pas disponibles ou suffisamment grands pour que cela soit pratique, une alternative consiste à blanchir les plaques. Imprégnez les plaques d’une solution d’eau de Javel à 20% ou « 1 sur 5 » (en d’autres termes, 1 part d’eau de Javel et 4 parts d’eau). Laissez-les reposer et tremper toute la nuit dans la solution de blanchiment avant de les jeter. Veuillez noter que la solution d’eau de Javel est corrosive et doit être soigneusement éliminée par la suite. En outre, les plaques peuvent être incinérées si l’on a accès à un incinérateur.
Dorland, W.A.M. (2012). Dictionnaire médical de Dorland. Consulté le 17 janvier 2013 sur http://www.dorlands.com/wsearch.jsp
Université du Texas Health Science Center à Houston : http://med.uth.tmc.edu/
Endnotes
(1) « Plaque de gélose ». Wikipédia. http://en.wikipedia.org/wiki/Agar_plate, consulté le 14 janvier 2005.
(2) « Microbiologie. » Réseau MadSci. http://www.madsci.org/posts/archives/mar98/888937612.Mi.r.html, consulté le 25 janvier 2005.
(3) « Agars. » Manuel Difco & BBL. Consulté le 17 janvier 2013 à partir de http://www.bd.com/ds/technicalCenter/documents.asp
(4) Il s’agit du numéro de catalogue de la gélose nutritive. Veuillez suivre la description de l’article en bas, à côté du numéro de catalogue, et non la légende de l’image, qui indique une gélose non nutritive.
(5) « Bouteilles de gélose – Préparation & Utilisation du matériel. » Science Stuff, Inc. http://www.sciencestuff.com/playground/agar_bottle.shtml, consulté le 14 janvier 2005.
(6) Mott, et al. « Environnements artificiels pour la culture de bactéries ». WW Bio Institute. http://www.woodrow.org, (www.woodrow.org/teachers/esi/2002/Biology/Projects/lab_skills/ls5/), consulté le 14 janvier 2005.
(7) « Bouteilles de gélose – Préparation & Utilisation du matériel. » Science Stuff, Inc. http://www.sciencestuff.com/playground/agar_bottle.shtml, consulté le 14 janvier 2005.