BCR/ABL: dai meccanismi molecolari di induzione della leucemia al trattamento della leucemia mieloide cronica

Inibitori della proteina di fusione BCR/ABL

Siccome l’attività tirosin-chinasica deregolata di p210BCR/ABL è nota per essere l’evento trasformante essenziale nella CML, sono stati avviati studi volti a inibire questa attività TK (Lugo et al., 1990; Oda et al., 1995).

Sono stati valutati diversi inibitori della tirosin-chinasi nelle cellule CML (Boutin, 1994; Levitzki e Gazit, 1995). I primi ad essere testati sono stati isolati da fonti naturali, come gli antibiotici herbimycin-A, genisteina ed erbstatina che inibiscono l’attività della TK p210BCR/ABL in vitro, inibiscono la crescita di linee cellulari BCR/ABL+ in vitro e inducono la differenziazione eritroide della linea cellulare K562 (Carlo-Stella et al., 1996; Honma et al., 1989, 1990; Kawada et al., 1993; Okabe et al., 1992). Sono stati poi sviluppati composti sintetici, le tirfostine, e sono stati identificati AG957 e AG568 che inibiscono l’attività della TK p210BCR/ABL in vitro, e inducono la differenziazione eritroide e l’apoptosi della linea cellulare K562 (Anafi et al., 1993). Inoltre, AG957 ripristina l’adesione mediata dalla β1-integrina delle cellule primarie CML (Bhatia et al., 1998). AG957 ha anche un effetto antiproliferativo sinergico con il recettore anti-fas sui progenitori del CML (Carlo-Stella et al., 1999). Tuttavia, la bassa specificità per l’attività della TK BCR/ABL è un limite importante di questi inibitori TK.

STI571

Alla fine degli anni ’80, è stata identificata una 2-fenilaminopirimidina con specifica attività inibitoria della tirosin-chinasi contro il recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF-R), C-kit e ABL tirosin-chinasi, STI571 (ex CGP57148, ora Gleevec o imatinib mesilato) (Buchdunger et al, 1996; Druker e Lydon, 2000). Come le tirfostine, STI571 funziona legandosi alla tasca altamente conservata di legame nucleotidico del dominio catalitico dell’ABL-TK e bloccando competitivamente il legame di ATP (Schindler et al., 2000).

Studi preclinici hanno mostrato che STI571 inibisce specificamente la proliferazione delle cellule leucemiche, e ripristina la crescita e la differenziazione dipendenti dall’interleuchina-3 (IL-3) delle linee cellulari BCR/ABL+. La crescita delle cellule formanti colonie mieloidi CML è fortemente inibita da STI571 con effetti minimi sulla crescita delle colonie normali (Carroll et al., 1997; Deininger et al., 1997; Druker et al., 1996; Gambacorti-Passerini et al., 1997). Ciò è dovuto all’inibizione della proliferazione e, in misura minore, della morte cellulare (Holtz et al., 2002). La coltura a lungo termine di cellule BM con esposizione prolungata a STI571 ha mostrato un effetto inibitorio sui progenitori CML con poca tossicità per le cellule normali (Kasper et al., 1999). Tuttavia, fino al 30-40% delle LTC-IC Ph+ sopravvivono al trattamento con STI571 (Holtz et al., 2002). Inoltre, l’inibizione dell’attività della chinasi BCR/ABL da parte di STI571 risulta nella modifica trascrizionale di vari geni coinvolti nel controllo del ciclo cellulare, dell’adesione cellulare e dell’organizzazione citoscheletrica (Deininger et al., 2000), portando alla morte apoptotica di almeno alcune cellule Ph+. Studi sui topi hanno dimostrato un effetto in vivo di STI571 contro le cellule BCR/ABL+. Tuttavia, l’esposizione continua a STI571 era necessaria per sradicare i tumori generati da 32DBCR/ABL (le Coutre et al., 1999). Prima dei test clinici, STI571 ha dimostrato di avere un profilo di tossicità accettabile sugli animali (Druker e Lydon, 2000).

Un trial clinico di fase I con STI571 fu iniziato nel giugno 1998 (Druker et al., 2001b). Questo studio era uno studio di escalation della dose, progettato per stabilire la dose massima tollerata in 54 pazienti in fase cronica di CML che avevano fallito la terapia con IFN-α. I risultati sono riassunti nella tabella 1. Gli effetti collaterali sono stati minimi, senza tossicità limitanti la dose.

Gli studi di fase I sono stati estesi a pazienti con CML in crisi blastica mieloide e linfoide e pazienti con ALL Ph-positivo recidivato o refrattario. I pazienti sono stati trattati con dosi giornaliere di 300-1000 mg di STI571. I risultati sono riassunti nella tabella 2. STI571 ha una notevole attività come singolo agente nella crisi di blast CML e nell’ALL Ph-positivo, ma le risposte tendono a non essere durevoli (Druker et al., 2001a).

La fase I fu seguita da un ampio studio internazionale di fase II tra dicembre 1999 e maggio 2000, per valutare la sicurezza e l’efficacia di STI571 in pazienti con LMC refrattaria all’interferone e intollerante al Ph, nonché in pazienti con LMC in fase accelerata, LMC in crisi di blasti mieloidi e pazienti con LLA positiva al Ph (Kantarjian et al., 2002; Sawyers et al., 2000; Talpaz et al., 2002). Questo studio ha arruolato oltre 1000 pazienti in 27 centri in sei paesi per un periodo di 6-9 mesi. I risultati sono riassunti nella tabella 3. Lo studio ha confermato i risultati visti nella fase I ed è servito come base per l’approvazione accelerata della Food and Drug Administration (FDA) di STI572.

Da allora, uno studio randomizzato di fase III che confronta STI571 con interferone e citarabina in pazienti di nuova diagnosi ha raccolto oltre 1000 pazienti in un periodo di sei mesi, e la raccolta dei dati è in corso.

Clinicamente, la maggior parte dei pazienti che recidivano dopo una risposta iniziale a STI571 hanno una riattivazione della chinasi BCR/ABL (Gorre et al, 2001). Studi in vitro in linee cellulari BCR/ABL-positive murine e umane resistenti a STI571 hanno dimostrato che un meccanismo frequente di resistenza a STI571 è l’amplificazione e la sovraespressione del gene BCR/ABL (le Coutre et al., 2000; Mahon et al., 2000). Anche la sovraespressione della glicoproteina Pgp, il prodotto del gene della resistenza ai farmaci (MDR), può contribuire al fenotipo resistente. Approssimativamente, un terzo dei pazienti che recidivano dopo una risposta iniziale hanno un’amplificazione BCR/ABL (Gorre et al., 2001). È interessante notare che la metà di questi pazienti ha sviluppato mutazioni puntiformi nel dominio della chinasi ABL che risultano in una ridotta sensibilità a STI571 (Barthe et al., 2001; Gorre et al., 2001; Hochhaus et al., 2001). Almeno una delle mutazioni puntiformi si trova in un sito predetto come sito di contatto tra la chinasi ABL e STI571 (Gorre et al., 2001). Diverse mutazioni puntiformi sono in residui adiacenti ai punti di contatto, mentre altre sono nel ciclo di attivazione della chinasi (Barthe et al., 2001; Gorre et al., 2001; Hochhaus et al., 2001). Tuttavia, la mutazione o l’amplificazione BCR/ABL non sono state comunemente viste in pazienti con resistenza de novo a STI571 e sono in corso studi per identificare il meccanismo della resistenza primaria in questi pazienti.

L’inibizione dell’attività della chinasi del recettore ABL, PDGF e c-kit da parte di STI571 può potenzialmente interferire con la normale funzione cellulare. Tuttavia, il grado trascurabile di effetti collaterali osservati negli studi clinici di STI571 suggerisce che vie alternative possono compensare la soppressione delle normali chinasi ABL, PDGF e c-kit.

Inibitori di altre proteine di trasduzione del segnale

Inibitori della Farnesil transferasi (FTI)

Questa strategia è basata sulla nozione che l’attivazione RAS gioca un ruolo centrale nella trasformazione leucemogenica da BCR/ABL (Cortez et al, 1996; Goga et al., 1995; Mandanas et al., 1993; Pendergast et al., 1993; Puil et al., 1994; Sanchez-Garcia e Martin-Zanca, 1997; Sawyers et al., 1995; Senechal et al., 1996). L’inibizione della segnalazione RAS attraverso l’espressione di RAS dominante-negativo, il blocco della funzione della proteina adattatrice Grb2 o l’incubazione con oligonucleotidi antisenso a p21Ras, previene la trasformazione BCR/ABL in diversi modelli di linee cellulari (Gishizky et al., 1995; Sawyers et al., 1995; Sakai et al., 1994; Skorski et al., 1994a). La funzione di Ras dipende dalla corretta localizzazione subcellulare sulla membrana plasmatica attraverso l’aggiunta di un gruppo farnesilico a 15 carati a Ras, una reazione catalizzata dall’enzima farnesil protein transferasi (FPT) (Gutierrez et al., 1989; Hancock et al., 1989; Long et al., 2001; Reiss et al., 1990; Stokoe et al., 1994). Gli inibitori della Farnesyl protein transferase (FTI) sono una classe di farmaci progettati per bloccare specificamente la segnalazione oncogenica di Ras e la trasformazione cellulare Ras-dipendente (Gibbs et al., 1994). Gli FTI interrompono la prenilazione di Ras e senza una corretta localizzazione subcellulare, Ras non è più oncogeno (Kato et al., 1992). Diversi studi hanno dimostrato la potente attività antitumorale degli FTI in vitro contro le cellule tumorali murine e umane trasformate da Ras e in vivo contro la formazione di tumori Ras-specifici in modelli murini transgenici e xenografici (End, 1999; Gibbs et al., 1997; Kohl et al., 1993, 1994; Nagasu et al., 1995; Rowinsky et al., 1999). Tuttavia, è stato riportato che l’FTI inibisce anche la crescita di cellule trasformate che mancano di Ras mutante, suggerendo che anche altri meccanismi sono coinvolti (Liu et al., 1998; Sepp-Lorenzino et al., 1995). Per esempio, in presenza di dosi inibitorie di FTI, alcune proteine substrati diventano alternativamente prenilate dalla geranyl-geranyl protein transferase. Come forma alternativamente prenilata di RhoB esercita effetti anti-proliferativi sulle cellule trasformate (Lebowitz et al., 1997; Lebowitz e Prendergast, 1998). Quest’ultimo potrebbe essere responsabile dell’effetto visto da FTI sulla proliferazione cellulare. Incoraggianti studi preliminari hanno documentato che l’FTI inibisce la proliferazione in vitro delle cellule di ALL e della leucemia mieloide cronica giovanile (JCML) (Emanuel et al., 2000). Uno studio di fase I di dose-escalation è stato condotto con l’FTI R115777 in 35 adulti con leucemie acute refrattarie e recidivate (Karp et al., 2001). Risposte cliniche si sono verificate nel 29% dei 34 pazienti valutabili, incluse due remissioni complete. I risultati di questo studio forniscono la prima prova del successo dell’inibizione dell’FT nelle cellule neoplastiche in vivo e suggeriscono che l’FTI può essere una modalità antileucemica promettente.

Inoltre, SCH66336, un FTI orale, inibisce potentemente la formazione di colonie in soft agar, rallenta la proliferazione e sensibilizza le linee cellulari BCR/ABL+ agli stimoli apoptotici (Peters et al., 2001). Quando somministrato a topi con leucemia indotta da BCR/ABL, SCH66336 ha aumentato la sopravvivenza da 4 settimane (senza terapia) a più di un anno. Tuttavia, quando lo SCH66336 è stato ritirato gli animali hanno sviluppato la leucemia. È stata anche dimostrata la capacità dello SCH66336 di inibire la formazione di colonie di cellule CML primarie (Peters et al., 2001). Questi risultati mostrano che i composti FTI sono altamente efficaci come agenti singoli contro le cellule ematopoietiche trasformate da BCR/ABL, identificando gli FTI come un potenziale trattamento clinico per la leucemia indotta da BCR/ABL. Un altro studio ha riportato l’efficacia dello SCH66336 nel trattamento della leucemia linfoblastica acuta BCR/ABL-positiva in topi transgenici P190 (Reichert et al., 2001). Ulteriori studi preclinici sugli animali determineranno i meriti dell’uso di FTI in combinazione con altri trattamenti, come gli inibitori delle tirosin-chinasi, per trattare la leucemia indotta da BCR/ABL.

Inibitori del proteasoma

Il proteasoma è una proteasi multicatalitica presente in tutte le cellule eucariotiche e costituisce il componente primario della via di degradazione delle proteine della cellula. Degradando le proteine regolatrici (An et al., 2000; Dietrich et al., 1996; Pagano et al., 1995; Wu et al., 2000), il proteasoma è fondamentale per l’attivazione o la repressione di molti processi cellulari, compresa la progressione del ciclo cellulare e l’apoptosi (Adams et al., 1999; Imajoh-Ohmi et al., 1995). Studi in vitro e su xenotrapianti di topo hanno mostrato un’attività antitumorale degli inibitori del proteasoma in una varietà di tipi di tumore, compresi i tumori del pancreas, della prostata e del colon, il mieloma e la leucemia linfocitica cronica (Adams, 2002; Hideshima et al., 2001; Shah et al., 2001). Diversi studi hanno indagato l’ipotesi che il proteasoma possa avere un ruolo nella regolazione della funzione BCR/ABL. Gli effetti degli inibitori del proteasoma come le aldeidi tripeptidiche, la lattacistina e il PSI sono stati studiati in diverse linee cellulari leucemiche umane. L’inibizione del proteasoma provoca un aumento della morte apoptotica e il potenziamento dell’effetto dei farmaci citotossici in un certo numero di linee cellulari mieloidi (Dou et al., 1999; Drexler, 1997; Shinohara et al., 1996; Soligo et al., 2001). Questo processo comporta l’attivazione delle caspasi, la perturbazione dell’espressione delle proteine della famiglia Bcl-2 e la diminuzione dell’espressione di p210BCR/ABL. È interessante notare che gli inibitori del proteasoma diminuiscono prima i livelli di attività della tirosin-chinasi p210BCR/ABL e, successivamente, attivano il programma di morte apoptotica nelle cellule K562 (Soligo et al., 2001). Questi risultati suggeriscono che l’inattivazione della funzione BCR/ABL da parte degli inibitori del proteasoma è essenziale per l’induzione dell’apoptosi nelle linee cellulari leucemiche. Nelle cellule primarie, la sensibilità al PSI è tre volte superiore nei progenitori CD34+ della CML rispetto ai progenitori normali. L’osservazione che le cellule trasformate sono più sensibili al blocco del proteasoma rispetto alle cellule normali, è stata riportata nelle cellule leucemiche rispetto alle cellule normali (Adams, 2002). Mentre il meccanismo esatto di questa suscettibilità differenziale non è completamente compreso, l’inibizione del proteasoma può invertire alcuni dei cambiamenti che permettono la proliferazione e sopprimono l’apoptosi nelle cellule maligne. L’inibitore del proteasoma PS-341 è stato il primo inibitore del proteasoma ad entrare nella sperimentazione umana. Sei studi clinici di fase I per PS-341 in tumori ematologici o solidi sono stati completati o sono in corso (Papandreou et al., 2001; Stinchcombe et al, 2000), e la sicurezza e l’efficacia del trattamento con PS-341 per il mieloma multiplo refrattario e la LLC sono state testate in due studi di fase II in corso.

Immunomodulazione

Questo sarà discusso solo brevemente e rimandiamo i lettori a eccellenti recensioni che sono state pubblicate recentemente (Apperley et al, 1998; Campbell et al., 2001; Clark e Christmas, 2001; Claxton et al., 2001; Dazzi et al., 1999; Goodman et al., 1998; Pinilla-Ibarz et al., 2000b). Anche se il meccanismo non è completamente compreso, questo dimostra che le cellule immunoregolatrici possono eliminare specificamente i progenitori leucemici e le cellule staminali. La GVHD associata a questa terapia costituisce il maggior limite di questa terapia. Tuttavia, la deplezione selettiva dei linfociti T CD8+ del donatore o la trasduzione dei linfociti T del donatore con il gene della timidina chinasi dell’herpes simplex può permettere ai medici di controllare la GVHD (Ackerman et al., 1978; Barrett et al., 1998; Giralt et al., 1995; Nimer et al., 1994; Tiberghien et al., 1994). La cocoltura di linfociti del donatore con cellule leucemiche dell’ospite o con cellule leucemiche dendritiche che presentano l’antigene di pazienti CML può essere fatta per generare ed espandere CTL specificamente reattivi contro i progenitori CML (Choudhury et al., 1997; Faber et al., 1995; Falkenburg et al., 1993; Jiang e Barrett, 1995; Molldrem et al., 1997; Warren et al., 1998) ex vivo. Lo sviluppo di vaccini per la CML è un altro valido approccio. In questa terapia, i peptidi BCR/ABL-specifici sono espressi sulle molecole MHC per generare una risposta CTL specifica per la leucemia. Diversi studi hanno dimostrato lo sviluppo di una risposta immunitaria specifica. Resta da vedere se tali vaccini saranno sufficienti per trattare efficacemente la CML (Bocchia et al., 1995, 1996; Bosch et al., 1996; Pinilla-Ibarz et al., 2000a; ten Bosch et al, 1999).

La somministrazione di dosi basse o intermedie di IL2 dopo SCT allogenico o l’espansione ex vivo di cellule NK autologhe con IL2 prima della reinfusione aumenta il numero e attiva le cellule NK nei pazienti con CML e può essere utile per eliminare residui minimi della malattia (Robinson et al., 1996; Soiffer et al., 1994; Vey et al., 1999).