Glycolysis
The Embden-Meyerhof-Parnas Pathway
Glycolysis può essere ampiamente definita come una via di produzione di energia che risulta nella scissione di un esoso (glucosio) in un trioso (piruvato). Sebbene il termine sia spesso considerato sinonimo della via Embden-Meyerhof-Parnas (EMP), esistono altre vie glicolitiche, tra cui la via Entner-Doudoroff che procede attraverso un intermedio dell’acido gluconico e un complesso insieme di riarrangiamenti che procede attraverso un intermedio pentoso (Figura 1).
Figura 1. Le vie glicolitiche di Escherichia coli. La via più a sinistra è la via Emden-Meyerhof-Parnas; quella più a destra è la via Entner-Doudoroff. I geni che codificano per gli enzimi principali dei percorsi sono mostrati in corsivo. Le frecce in grassetto indicano la produzione o il consumo di legami ad alta energia (sotto forma di ATP o PEP) o potere riducente (come NADH o NADPH). La linea curva in grassetto vicino alla parte superiore della figura rappresenta la membrana citoplasmatica; le reazioni al di sopra di quella linea curva avvengono nel periplasma, quelle al di sotto avvengono nel citoplasma.
La via EMP è presente in organismi di ogni ramo dei batteri, archaea ed eukarya. Chiaramente, questo è un adattamento evolutivo precoce, probabilmente presente nell’antenato di tutte le forme di vita attuali. Questo suggerisce che il percorso EMP si è evoluto in un mondo anaerobico e fermentativo. Tuttavia, il percorso funziona anche in modo efficiente come base per la respirazione aerobica del glucosio. Le differenze tra fermentazione e respirazione risiedono in gran parte nei diversi destini del piruvato prodotto (vedi più avanti). Per semplicità, questa discussione si concentra sulla via EMP nel noto batterio Escherichia coli, anche se le caratteristiche di base della via sono quasi universali.
Prima che il metabolismo del glucosio inizi, deve essere trasportato nella cellula e fosforilato. In E. coli, questi due processi sono intimamente accoppiati in modo tale che il glucosio è fosforilato dal sistema fosfotransferasi (PTS) mentre passa nella cellula. Poiché il glucosio-6-fosfato (G-6-P), come la maggior parte se non tutti i fosfati di zucchero, è tossico ad alte concentrazioni cellulari, questo processo di trasporto è strettamente regolato. La trascrizione del gene del trasportatore specifico del glucosio, ptsG, è massima solo quando si accumula l’adenosina monofosfato ciclico (cAMP) (che segnala la limitazione di energia). Inoltre, la traduzione dell’RNA messaggero ptsG (mRNA) è inibita dal piccolo RNA sgrS, che viene prodotto quando si accumula G-6-P. Così, l’importazione e la concomitante fosforilazione a G-6-P è ridotta ogni volta che la richiesta di più energia è bassa o la concentrazione di G-6-P è pericolosamente alta.
In assenza di una proteina PtsG, altri trasportatori legati a PTS, specialmente il trasportatore mannoso-specifico, ManXYZ, possono anche trasportare e fosforilare il glucosio. Tuttavia, i mutanti ptsG crescono più lentamente sul glucosio rispetto ai ceppi wild-type. Il glucosio libero può anche accumularsi intracellularmente dalla degradazione di oligosaccaridi contenenti glucosio come il lattosio o il maltosio. L’ingresso del glucosio intracellulare nella via EMP avviene tramite un’esochinasi codificata dal gene glk.
Le due fasi successive della via EMP preparano il G-6-P per la scissione in due triosio fosfati. In primo luogo, una fosfoglucosio isomerasi reversibile (gene pgi) converte il G-6-P in fruttosio-6-fosfato. Un mutante pgi può ancora crescere lentamente sul glucosio usando altre vie glicolitiche (vedi più avanti), ma la via EMP è bloccata in un mutante pgi. Il fruttosio-6-fosfato risultante è ulteriormente fosforilato in posizione C1 a fruttosio-1,6,-bisfosfato a spese dell’adenosina trifosfato (ATP) da una fosfofruttochinasi codificata da pfkA. Un secondo isozima minore della fosfofruttochinasi codificata da pfkB permette una crescita lenta dei mutanti pfkA. Un insieme potenzialmente concorrente di fosfatasi che rimuovono il fosfato C1 dal fruttosio-1,6,-bisfosfato funziona durante la gluconeogenesi, ma è controllato durante la glicolisi da una varietà di meccanismi di feedback per prevenire cicli futili.
La prossima reazione nel percorso è la scissione del fruttosio-1,6-bisfosfato in due fosfati di triosio che dà al percorso il suo nome (glicolisi = rottura dello zucchero). Questa reazione reversibile è effettuata dalla fruttosio bisfosfato aldolasi (gene fbaA) e produce come prodotti il diidrossiacetone fosfato (DHAP) e la gliceraldeide fosfato (GAP). Una seconda aldolasi non correlata (gene fbaB) è prodotta solo durante la gluconeogenesi e quindi non svolge alcun ruolo nella glicolisi. I due fosfati di triosio sono liberamente interconvertibili attraverso la triosephosphate isomerase (gene tpi). Il DHAP è un substrato chiave per la biosintesi dei lipidi. GAP è un nodo importante nella glicolisi; altre due vie glicolitiche comuni (vedi sotto) si uniscono alla via EMP a GAP.
Fino a questo punto, la via EMP può essere considerata come una via biosintetica poiché produce tre componenti biosintetici chiave (G-6-P, fruttosio-6-fosfato e DHAP) a spese dell’ATP e senza alcuna fase ossidativa. Il passo successivo è la fosforilazione ossidativa del GAP in acido 1,3-difosfoglicerico, un composto ad alta energia. L’incorporazione del fosfato inorganico da parte della GAP deidrogenasi (gene gapA) è accoppiata alla riduzione di NAD+ a NADH. In condizioni aerobiche, questo NADH è riossidato utilizzando la catena respiratoria per produrre ATP. In condizioni anaerobiche, questo NADH viene riossidato accoppiandosi alla riduzione dei prodotti derivati dal piruvato o da altri intermedi della via EMP. L’enzima fosfoglicerato chinasi (gene pgk) quindi fosforila l’adenosina difosfato (ADP) in ATP a spese del fosfato C1 dell’1,3-difosfoglicerato. Questa è la prima di due fosforilazioni a livello di substrato in cui il fosfato viene trasferito da un substrato altamente reattivo direttamente all’ADP senza il coinvolgimento dell’ATP sintasi di membrana.
Le due fasi successive riorganizzano il 3-fosfoglicerato risultante nell’ultimo intermedio ad alta energia della via, il fosfoenolpiruvato (PEP). In primo luogo, il fosfato viene trasferito dalla posizione C3 alla posizione C2 da una fosfoglicerato mutasi. Ci sono due isozimi evolutivamente non correlati, uno dei quali (codificato dal gene gpmA) richiede un 2,3-bisfosfoglicerato come cofattore e l’altro (gene gpmM) no. Sebbene E. coli, Bacillus subtilis, e alcuni altri batteri abbiano entrambi gli isozimi, molti organismi hanno solo uno o l’altro. Per esempio, il lievito Saccharomyces cerevisiae, il batterio Mycobacterium tuberculosis e tutti i vertebrati hanno solo l’enzima cofattore-dipendente, mentre le piante superiori, gli archei e il batterio Pseudomonas syringae hanno solo l’enzima cofattore-indipendente. Un terzo isozima (gene ytjC) sembra esistere in E. coli, anche se il suo ruolo è meno chiaro.
Il 2-fosfoglicerato riorganizzato viene poi disidratato da un’enolasi (gene eno) per produrre l’intermedio chiave, PEP. Anche se il piruvato è generalmente considerato il prodotto finale della via EMP, si può sostenere che la PEP condivida questo onore. Il PEP è la fonte finale di fosfato per il trasporto/fosforilazione mediata da PtsG del glucosio che dà inizio al percorso. Inoltre, l’enzima enolasi è una parte necessaria del degradasoma che funziona con il piccolo RNA sgrS (descritto in precedenza) per inibire la traduzione dell’mRNA ptsG e stimolare la degradazione dell’mRNA ptsG. Questo riduce la generazione dell’accumulo altrimenti tossico di G-6-P.
Vale la pena notare che PEP è un punto di diramazione sia in condizioni aerobiche che anaerobiche. La carbossilazione della PEP da parte della PEP carbossilasi (gene ppc) fornisce ossalacetato, che si condensa con l’acetil-CoA derivato dal piruvato per formare citrato per far funzionare sia il ciclo dell’acido tricarbossilico (TCA) che lo shunt del gliossilato in modo aerobico. Durante la fermentazione, questo stesso ossalacetato è un intermedio nella via riduttiva (NAD rigenerante) per il succinato. Inoltre, l’ossalacetato derivato dal PEP è usato (attraverso una porzione del ciclo TCA) per la biosintesi dell’acido glutammico anche in condizioni anaerobiche.
L’ultima reazione è una fosforilazione a livello di substrato di ADP in ATP a spese del PEP per produrre piruvato. I due isozimi della piruvato chinasi (geni pykA e pykF) sono attivati dai fosfati di zucchero e il prodotto del gene pykF mostra una cooperatività positiva rispetto al substrato PEP, tendendo di nuovo a prevenire l’accumulo di questo intermedio fosforilato e impedendo così la generazione di più G-6-P attraverso il meccanismo di trasporto PtsG dipendente dal PEP.
Al termine della via EMP, 1 mol di glucosio viene convertita in 2 mol di piruvato, che può essere utilizzato per un ulteriore catabolismo o per la biosintesi. Produce anche 2 mol di ATP e 2 mol di NADH (che deve essere riossidato perché la via continui a funzionare). Poiché la via genera diversi intermedi tossici, non è sorprendente che il flusso attraverso la via sia strettamente regolato. Gli enzimi della via rispondono rapidamente alle variazioni della domanda e dell’offerta attraverso l’inibizione di ritorno e l’attivazione del substrato delle attività enzimatiche. Rispondono anche (più lentamente) attraverso la regolazione trascrizionale dell’espressione genica in risposta a regolatori globali che variano da organismo a organismo.
La via EMP funziona per generare sia intermedi biosintetici che energia catabolica dal glucosio. Tuttavia, serve anche come linea centrale del tronco in cui si alimentano molte altre vie cataboliche. G-6-P, fruttosio-6-fosfato, DHAP e GAP sono punti di giunzione comuni in cui le vie cataboliche degli zuccheri, degli alcoli, dei grassi e degli acidi organici confluiscono nella via EMP.