Microscopia a contrasto di fase
Introduzione
La microscopia a luce offre una tecnica potente per l’imaging senza etichette di campioni biologici come le cellule. L’imaging senza etichette è particolarmente adatto per comprendere meglio le cellule, in quanto sono prive di qualsiasi modifica che potrebbe potenzialmente alterare la struttura, la funzione o il comportamento.
Tuttavia, la microscopia ottica standard soffre di limitazioni di basso contrasto, poiché la maggior parte dei campioni biologici nativi non assorbono la luce (le cellule sono essenzialmente piccole sacche trasparenti di acqua). I cambiamenti nell’indice di rifrazione che disperdono la luce possono anche rivelare la struttura, ma le differenze tra l’indice di rifrazione delle cellule, le strutture subcellulari e la loro matrice circostante sono spesso basse o trascurabili. Questo porta ai bassi livelli di contrasto inerenti ai campioni trasparenti che limitano la microscopia ottica e altre tecniche senza etichetta come applicazioni di ricerca.
Ci sono diversi metodi di imaging che generano contrasto in questi campioni. Uno di questi metodi è la microscopia a contrasto di fase. Questa tecnica ottica converte le differenze nella lunghezza del percorso ottico o nell’indice di rifrazione del campione in spostamenti di fase della luce e usa questi spostamenti di fase per creare contrasto. Utilizzando sottili modifiche del regolare percorso ottico in campo chiaro, il contrasto di fase permette la visualizzazione di dettagli come gli organelli intracellulari, in questi campioni altrimenti privi di caratteristiche e senza etichetta.
Questo articolo introduce la fase della luce e il meccanismo della microscopia a contrasto di fase. Verrà discussa l’impostazione del microscopio per eseguire l’imaging a contrasto di fase, nonché alcune delle applicazioni e dei vantaggi e delle limitazioni associate.
Che cos’è la fase della luce?
Le onde luminose possono essere matematicamente descritte come un’onda sinusoidale, come illustrato in Fig.1 L’ampiezza dell’onda corrisponde alla sua intensità, che viene interpretata come luminosità quando viene percepita dall’occhio. La lunghezza d’onda della luce, e il suo inverso, la frequenza, determina l’energia e il colore. Nella Fig.1, l’onda rossa è sfasata rispetto all’onda blu.
La fase di un’onda in un dato punto nello spazio o nel tempo si riferisce a dove lungo la sinusoide l’onda è in quel particolare punto, cioè l’onda è in un picco, una depressione, o da qualche parte nel mezzo? Per esempio, due gabbiani che galleggiano sul mare possono essere ad altezze diverse – la lunghezza d’onda e l’ampiezza massima delle onde sono le stesse in entrambi i casi, ma la fase è diversa. Matematicamente, definiamo la fase in gradi o radianti, rispetto a qualche punto di riferimento lungo l’onda sinusoidale – per esempio, potremmo definire il picco dell’onda dove il gabbiano è al suo massimo come 0°. Il punto più basso sarebbe quindi a 180° (π radianti), e il punto di transizione tra i due sarebbe 90° (π/2 radianti). La differenza di fase tra le onde rosse e blu in Fig.1 è 90°.
Le onde luminose possono interferire tra loro se hanno la stessa frequenza e fasi ben ordinate, con il risultato che dipende dalla differenza di fase tra le onde. Per esempio, le onde che hanno la stessa frequenza e sono perfettamente fuori fase (differenza di fase di 180°) si allineerebbero di picco in picco, portando ad un’interferenza distruttiva e risultando in ampiezza 0, le due onde si annullano perfettamente. Allo stesso modo, le onde che sono perfettamente in fase si allineano picco a picco (0° di differenza di fase) e quindi interferirebbero costruttivamente, combinando le intensità in un’onda con il doppio dell’ampiezza.
Che cos’è la lunghezza del percorso ottico?
La luce si muove nel vuoto alla velocità della luce (300.000 km/s). Se la luce si muove attraverso una sostanza più densa, si muove più lentamente, a seconda dell’indice di rifrazione (RI) del mezzo attraverso cui la luce si muove. Più alto è il RI, più lenta è la luce. In alternativa potremmo rappresentare questo ritardo come se la luce dovesse viaggiare più lontano alla stessa velocità. Questa è la lunghezza del cammino ottico (OPL), che è data dalla distanza percorsa attraverso una sostanza, moltiplicata per la sua RI.
Se due onde con la stessa lunghezza d’onda partono dallo stesso punto e prendono percorsi diversi prima di raggiungere lo stesso punto, ci sarà probabilmente una differenza di OPL. A meno che questa differenza non sia un multiplo preciso della lunghezza d’onda, ci sarà quindi una differenza di fase tra le due onde. Questo significa che le differenze di fase nella luce dello stesso campione possono essere introdotte costringendo una parte della luce a viaggiare più lontano. Questo è il concetto alla base del contrasto di fase.
Microscopia a contrasto di fase
La microscopia a contrasto di fase fu descritta per la prima volta dal fisico olandese Frits Zernike negli anni ’30, e per questo gli fu poi assegnato il premio Nobel per la fisica (1953). Il contrasto di fase è una tecnica che sfrutta la capacità di alcuni campioni al microscopio di alterare l’OPL della luce che lo attraversa, aggiungendo contrasto attraverso l’interferenza della luce di fasi diverse.
I campioni trasparenti non colorati (come le cellule) non assorbono la luce e sono chiamati oggetti di fase. Quando la luce passa attraverso un’area del campione senza oggetto di fase, non c’è nessun cambiamento significativo nel RI o OPL, quindi non si verifica nessuna diffrazione significativa (Fig.2). Questa luce che non viene diffratta viene spesso indicata come luce diretta o di ordine zero in quanto continua immutata attraverso il campione.
D’altra parte, quando la luce passa attraverso un’area del campione con un oggetto di fase (come le strutture cellulari), piccoli cambiamenti nella RI diffrangono e disperdono una parte della luce e causano cambiamenti nell’OPL, a seconda dello spessore e della RI di ogni struttura. Più spessa è la struttura, maggiore è la diffrazione della luce.
La luce diffratta è una piccola parte della luce totale che è passata attraverso il campione. Questa luce diffratta (che è passata attraverso un oggetto di fase) arriva al rivelatore fuori fase rispetto alla luce diretta (che non è passata attraverso un oggetto di fase). Questo piccolo spostamento di fase non è sufficiente a causare un’interferenza significativa tra la luce diretta e quella diffratta, che insieme allo scarso assorbimento delle strutture trasparenti significa che c’è poca differenza di ampiezza tra le aree dove tali strutture sono presenti e quelle dove non lo sono.
La microscopia a contrasto di fase è un metodo che manipola questa proprietà degli oggetti di fase per introdurre un’ulteriore interferenza tra la luce diretta e quella diffratta. Questa tecnica trasforma le differenze di fase in differenze di luminosità, aumentando il contrasto nelle immagini di campioni non assorbenti.
Come viene implementato il contrasto di fase? Come sfasare la luce diffusa o la luce diretta ma non entrambe, e come ottenere una luce con una fase ben ordinata per illuminare il campione. Sorgenti di luce con una fase uniforme non esistevano prima dell’invenzione del laser (anni ’60).
Si sapeva che costringendo la luce attraverso un piccolo foro stenopeico si generava un’onda luminosa in espansione con una fase ben organizzata, ma a spese di una grande perdita di intensità. Quest’onda circolare veniva facilmente convertita in un’onda piatta con una lente. Il contrasto di fase compromette l’intensità della luce e la fase uniforme utilizzando un anello circolare (anulus) di illuminazione. Questo anello agisce in modo simile a un anello di fori di spillo, con qualsiasi direzione particolare intorno all’anello che ha la stessa fase, anche se la fase varierebbe irregolarmente intorno all’anello.
Per sfasare la luce diffusa o diretta, un’ottica sfasatrice (come un disco di vetro) è posta nel percorso della luce dove influenzerebbe prevalentemente la luce diretta. In Fig.3, un piano di luce ben ordinato inizia a sinistra. Come la luce colpisce il campione, la fase e la direzione della luce diffratta (linee solide a destra del campione) e diretta (linee tratteggiate) cambiano. L’obiettivo prende la luce diffusa e la focalizza in onde ordinate, mentre la luce diretta è focalizzata verso il centro ottico, dove è posto il materiale sfasatore. Questo porta la luce diffusa e la luce diretta di nuovo in fase, permettendo la generazione del contrasto attraverso l’interferenza all’arrivo al rivelatore.
Un microscopio a contrasto di fase con illuminazione anulare è raffigurato in Fig.4. Implementato in un moderno microscopio con correzione all’infinito, l’anello di sfasamento è situato sul piano focale posteriore dell’obiettivo. I due componenti necessari per convertire un microscopio tradizionale a campo chiaro in un microscopio a contrasto di fase sono il diaframma anulare posto nell’apertura posteriore del condensatore e la piastra di fase interna otticamente abbinata. La piastra di fase viene introdotta nel percorso della luce sul piano focale posteriore, spesso incisa in modo permanente su uno degli elementi della lente interna dell’obiettivo (come la lente del tubo di Fig.3). Questa piastra di fase diminuisce la luce diretta per far corrispondere meglio l’intensità della luce diffratta, e quindi ridurre ulteriormente il contributo della luce di fondo all’immagine.
La luce che passa attraverso il campione viene rifratta o diffratta a causa di caratteristiche con diversi indici di rifrazione, creando nuovi percorsi ottici. Quasi tutti questi nuovi percorsi ottici non passeranno attraverso le aree di attenuazione della piastra di fase, ma passeranno invece attraverso il centro non attenuante dell’anello di fase.
I fronti d’onda che vengono diffratti in varia misura passando attraverso il campione si sovrappongono ai fronti d’onda diretti spostati nel piano dell’immagine intermedia. Tenendo conto dello spostamento di 90°, la differenza di fase totale è vicina a 1 per uno spostamento positivo, che porta all’interferenza distruttiva, o a 0 per uno spostamento negativo, che porta all’interferenza costruttiva. Piccoli cambiamenti di RI, quindi, portano a grandi cambiamenti nell’interferenza.
Questo porta a oggetti con un RI più alto di quello che li circonda ad apparire scuri su uno sfondo luminoso, o luminosi su uno sfondo scuro a seconda che la tecnica sia rispettivamente a contrasto di fase positivo o negativo. Il contrasto di fase positivo è lo standard nei microscopi moderni, dove l’oscurità delle caratteristiche dell’oggetto aumenta con il loro indice di rifrazione, che simula l’effetto di assorbimento agli occhi di un osservatore.
Con l’aumentare dell’apertura numerica dell’obiettivo e dell’ingrandimento, la larghezza e il diametro della piastra di fase diminuiscono. Al contrario, all’aumentare dell’ingrandimento, aumenta la dimensione dell’anello del condensatore. Quindi, per ottenere immagini a contrasto di fase di alta qualità, è necessario utilizzare la coppia corretta di piastra di fase e anello del condensatore e l’anello del condensatore deve essere centrato correttamente in modo che l’immagine dell’anello corrisponda esattamente alla posizione dell’anello di fase. Esempi di questi anelli di fase e dell’immagine risultante, se confrontati con tecniche non di fase come il campo chiaro, possono essere visti in Fig.5.
Avantaggi e svantaggi del contrasto di fase
Avantaggi
Il principale vantaggio del contrasto di fase è la sua capacità di generare un contrasto di immagini da materiali che non assorbono la luce, comprese le cellule e i tessuti in cultura. Campioni sottili, trasparenti e incolori possono contenere dettagli così fini che, anche se assorbenti, non si vedono bene, come le ciglia e i flagelli. Ma questi stessi campioni mostrano un forte contrasto quando si usa il contrasto di fase. L’uso del contrasto di fase, quindi, permette di identificare strutture cellulari e componenti subcellulari come il nucleo e gli organelli (mitocondri, Golgi, granuli) con densità diverse. L’abilità di immaginare questi campioni con alto contrasto e risoluzione, senza la necessità di etichette, è una proprietà altamente vantaggiosa della microscopia a contrasto di fase.
Un altro vantaggio del contrasto di fase è la possibilità di combinarlo con altre tecniche, come la microscopia a fluorescenza per identificare componenti subcellulari attraverso un’etichettatura specifica. La combinazione di più metodologie offre l’opportunità di comprendere maggiori livelli di dettaglio da un singolo campione e fornisce nuove opportunità di ottenere ulteriori informazioni relative alla struttura e alla funzione subcellulare.
Alcuni campioni daranno luogo a un contrasto più forte quando si utilizzano metodi a contrasto di fase positivo o negativo. Per esempio, i globuli rossi umani mancano di contrasto nel contrasto di fase positivo ma hanno un alto contrasto quando si usa l’imaging di fase negativo. Al contrario, le cellule tumorali visualizzate con l’imaging di fase negativa mostrano poco contrasto, ma quando si visualizza con contrasto di fase positivo, il contorno della cellula così come i componenti interni, come gli organelli, mostrano un forte contrasto contro la matrice circostante. Capire la modalità più appropriata per un campione specifico dipende probabilmente dalla matrice (mezzi di imaging, mezzi di crescita), il campione stesso e le loro differenze RI.
Svantaggi
Un vincolo del contrasto di fase è che non funziona bene con campioni spessi perché gli spostamenti di fase da aree sotto o sopra il piano focale contribuiscono all’immagine dando luogo a sfocature fuori fuoco. Gli artefatti di fase ottici sono anche comuni, come gli aloni e i modelli di contrasto in ombra che possono essere presenti nelle immagini.
L’effetto alone è descritto dalla comparsa di un bordo luminoso per il contrasto di fase positivo o un bordo scuro per il contrasto di fase negativo intorno a grandi oggetti che oscurano i dettagli. Gli aloni si formano perché piccole quantità di luce diffusa dal campione possono anche attraversare l’anello di fase. Questa non è soggetta alla stessa interferenza sul piano dell’immagine, il che porta ad un’inversione del contrasto e alla comparsa di aloni ai confini di grandi oggetti. Gli aloni saranno luminosi in contrasto di fase positivo, e scuri in contrasto di fase negativo.
Lo shade-off è un altro problema presente nelle immagini in fase. Lo shade-off si riferisce al gradiente di intensità presente nei grandi oggetti in fase, che può essere il più luminoso al centro, simile all’intensità della matrice circostante. Questo si riduce gradualmente verso i bordi dell’oggetto. L’inverso è vero nell’ombreggiamento a contrasto di fase negativo, dove l’area centrale è scura, simile allo sfondo. Questo è causato dalla complicata relazione tra lunghezza del percorso e intensità, che non è lineare.
Un altro problema con il contrasto di fase è l’inversione del contrasto. Questo è causato dalla presenza di oggetti con un RI elevato accanto a oggetti con un RI inferiore, che appariranno più luminosi invece che più scuri (per il contrasto di fase positivo). Questo porta gli oggetti ad alto indice di rifrazione ad apparire luminosi, invece che scuri (in contrasto positivo).
La configurazione ha anche altre limitazioni tra cui la riduzione della risoluzione del sistema ottico a causa della restrizione dell’apertura numerica da parte degli anulari di fase. Questo può essere restrittivo se la risoluzione è una parte critica dell’esperimento di imaging.
Tuttavia, i vantaggi che il contrasto di fase offre per la ricerca biomedica e biologica superano di gran lunga gli artefatti o le limitazioni della tecnica, e l’uso del contrasto di fase ha rivoluzionato vari campi della biologia cellulare.
Sommario
Il contrasto di fase è una tecnica che può essere implementata su un microscopio tradizionale in campo chiaro con l’aggiunta di due componenti, la piastra di fase corrispondente nel condensatore e l’anello del condensatore, solitamente in una lente a contrasto di fase. Se configurato correttamente, il contrasto di fase offre un metodo eccellente per visualizzare campioni altrimenti trasparenti che sarebbero quasi invisibili con l’imaging tradizionale in campo chiaro.
L’imaging in fase supera le limitazioni inerenti all’imaging in assorbanza nella visualizzazione di componenti subcellulari ad alto contrasto senza la necessità di etichettatura specifica. Il contrasto di fase può anche essere usato per completare la microscopia a fluorescenza a causa della differenza nelle loro configurazioni ottiche.
Il contrasto di fase ha alcune limitazioni, come gli artefatti di fase ottica e la non linearità. Nel complesso, la tecnica ha contribuito significativamente come metodo di imaging ottico e continua ad avere un valore critico per una varietà di applicazioni diverse.