Modelli di visione aviaria ed esperimenti sul campo determinano il valore di sopravvivenza del mimetismo della falena pezzata

Fotografie di esemplari di falena pezzata (Biston betularia) erano necessarie per l’analisi digitale delle immagini. I dati fotografici sono stati ottenuti da tre musei nel sud dell’Inghilterra: Bristol Museum and Art Gallery, l’Arca di Exeter del Royal Albert Memorial Museum and Art Gallery, e il Museo di Storia Naturale dell’Università di Oxford. Le collezioni di Oxford sono degne di nota perché contengono gli esemplari raccolti da Kettlewell per i suoi originali esperimenti di predazione e riproduzione degli uccelli. È stato permesso l’accesso ai cassetti degli esemplari per la selezione delle forme typica e carbonaria più intatte di entrambi i sessi per il campionamento, con una selezione basata sulla completezza delle ali. A causa dell’età e della fragilità di tali esemplari, la cura nel maneggiare gli insetti appuntati era fondamentale.

Abbiamo usato una fotocamera Nikon D7000 DSLR che era stata precedentemente sottoposta a una conversione al quarzo (Advanced Camera Services Limited, Norfolk, UK) con la sostituzione del filtro UV interno con un foglio di quarzo trasparente, come da studi precedenti22,48. Questo ha permesso la piena sensibilità spettrale in tutto lo spettro aviario-visibile. Un obiettivo intercambiabile CoastalOpt 105 mm UV Macro APO è stato collegato in cui le fotografie nello spettro del visibile umano sono state prese con un filtro di blocco Baader UV-IR (trasmettendo 400-700 nm) e ultravioletti (UV) fotografie sono state prese utilizzando un filtro Baader UV pass (trasmettendo 315-400 nm) 23. Tutte le immagini sono state prese in formato RAW. Un’area all’interno delle collezioni è stata selezionata con una quantità minima di luce naturale e artificiale in modo da non interferire con l’attrezzatura di illuminazione, che consisteva in una lampada ad arco Iwasaki EYE Colour collegata a un reattore Ventronic, montata su un supporto di illuminazione fotografica PhotxPro con un ombrello Elinchrom collegato. La lampada ad arco è stata lasciata riscaldare per 15 minuti per consentire al bulbo di raggiungere almeno il 90% della sua piena potenza luminosa. Prima dell’uso, il filtro di blocco UV applicato sopra la lampada ad arco è stato rimosso con una spazzola d’acciaio per consentire uno spettro completo di lunghezze d’onda. Un foglio cilindrico di PTFE è stato posto intorno alla lampadina, o intorno all’esemplare (o agli esemplari) da fotografare se accessibile, per diffondere uniformemente la luce.

Se opportuno, una falena è stata rimossa dal cassetto degli esemplari e appuntata su uno sfondo di schiuma grigio neutro. Sono stati fotografati un massimo di tre esemplari per scatto per garantire che fossero tutti di dimensioni uniformi e che le ali non fossero fuori dall’inquadratura. Per eliminare qualsiasi effetto della variabilità dell’illuminazione, è stato incluso uno standard di riflettanza chiaro (95%) e scuro (5%) (Labsphere, Congleton, UK) insieme a una barra della scala posizionata sul lato più vicino agli esemplari. La fotocamera è stata posizionata direttamente sopra utilizzando un cavalletto o un treppiede con testa flessibile, prima di essere messa a fuoco per ottenere una nitidezza ottimale. Il tempo di esposizione è stato selezionato a seconda che si fotografasse con il filtro visibile o UV e ottimizzato per una corretta esposizione e per evitare la saturazione49. Un telecomando per l’otturatore della fotocamera è stato utilizzato per ridurre al minimo il rumore o il movimento non necessari.

Analisi del mimetismo dello sfondo naturale di riposo

Il mimetismo criptico tra la falena pezzata e i suoi sfondi naturali di riposo è stato esplorato modellando la visione aviaria per confrontare i contrasti cromatici e acromatici. Sono stati visitati boschi in aree poco inquinate per ottenere fotografie in situ di cortecce di alberi semplici e foto di cortecce con licheni crostosi. Quercia (Quercus robar) e frassino (Fraxinus excelsior) alberi sono stati selezionati in base alla loro idoneità come sfondi naturali di riposo come identificato attraverso precedenti esperimenti falena pepata21,28. Selezione di specie di licheni crostosi, Lecidella elaeochroma e Graphis scripta, in contrasto con licheni foliosi, si è basata su precedenti lavori4,21,45, e perché gli esperimenti precedenti mostrano che licheni crostosi è più comunemente situato su tronchi d’albero e i lati inferiori dei rami principali28, che sono i luoghi naturali di riposo più frequentati dal peppered moth11. Le prove contro l’uso di licheni fogliosi sono supportate da popolazioni ancestrali trovate sui rami superiori, mentre i licheni crostosi fioriscono sotto i rami in luoghi non inquinati4. 130 alberi individuali sono stati selezionati in base alla precedente idoneità delineata, fotografando 65 esemplari con corteccia liscia e 65 esemplari con corteccia coperta da licheni sotto luce neutra durante le ore diurne, utilizzando la stessa fotocamera Nikon D7000 e le stesse lenti della collezione di esemplari del museo. Uno standard di riflettanza chiaro e scuro e una barra di scala sono stati posizionati in ogni fotografia per correggere la scalatura e qualsiasi differenza di illuminazione incontrata durante l’analisi delle immagini.

Per preparare le immagini per l’analisi, ogni foto è stata convertita in un’immagine multispettrale utilizzando il software ad accesso aperto ImageJ50 con il plugin Image Calibration and Analysis Toolbox23. Un’immagine RAW sia in UV e visibile è stato selezionato per ogni campione, e schermato prima di questo per verificare la sovraesposizione. Gli standard di riflettanza chiaro e scuro sono stati selezionati individualmente per normalizzare i canali e conto di potenziali variazioni nelle condizioni di luce49. Allineamento manuale è stato poi condotto sui canali RGB visibile e UV dell’immagine multispettrale 32-bit stack per misurazioni accurate del colore. Per ogni campione dei due diversi tipi di sfondo, un singolo morfo di falena typica o carbonaria è stato confrontato una volta per selezione casuale, per determinare come il colore e la luminanza (luminosità) contrastava tra la falena e il suo sfondo.

Per modellare la visione dei predatori aviari, è stata scelta la cinciallegra azzurra (Cyanistes caeruleus) perché studi precedenti hanno dimostrato che attaccano la falena pezzata10,11, il loro comportamento di foraggiamento può essere influenzato da segnali UV51, e in generale il loro sistema visivo è rappresentativo di molti uccelli passeriformi superiori19,52. Abbiamo usato un metodo consolidato per convertire le immagini calibrate dalla telecamera allo spazio colore animale (dati di risposta del cono previsti) utilizzando una tecnica di mappatura polinomiale23,49,53 in condizioni di illuminazione D65 (luce del giorno). Questo metodo è molto accurato nella generazione di dati di risposta del cono rispetto alla modellazione utilizzando gli spettri di riflettanza23,54,55. Anche se avremmo potuto usare uno spettro di irradiazione diverso (come un’ombra verde del bosco), questo non avrebbe influenzato i risultati per diverse ragioni. In primo luogo, il bosco non è infatti ombra continua, ma macchie di alberi e radure, e quindi una miscela di cielo aperto e illuminazione ombra della foresta. Inoltre, le falene reali e i modelli qui sarebbero effettivamente esposti a una serie di condizioni di luce associate all’ora del giorno, alla profondità nella foresta/copertura vegetale e al tempo. Inoltre, come la maggior parte delle altre modellazioni visive, teniamo conto del processo di costanza del colore, attraverso la cosiddetta trasformazione di von Kries56,57, e come tale, l’utilizzo di un diverso spettro di irraggiamento ha dimostrato di avere poco effetto sui valori di cattura del cono previsti57,58. Infine, per dimostrare pienamente che la nostra modellazione è robusta per l’illuminazione, abbiamo confrontato i valori di cattura dei coni previsti per 16 falene (otto typica e otto carbonaria) sotto entrambi gli spettri di irraggiamento D65 e ombra della foresta. Come previsto, i risultati sono stati invariati, con valori di cattura del cono medi più deviazione standard come segue: doppio (foresta = 0,22 ± 0,13, D65 = 0,21 ± 0,13), onde lunghe (foresta = 0,27 ± 0.15, D65 = 0.27 ± 0.15), onde medie (foresta = 0.20 ± 0.13, D65 = 0.20 ± 0.13), onde corte (foresta = 0.14 ± 0.10, D65 = 0.14 ± 0.10), ultravioletto (foresta = 0.08 ± 0.06, D65 = 0.07 ± 0.06). In tutti i casi, c’era una correlazione molto forte e significativa tra i valori di cattura dei coni nelle due condizioni di luce (test di correlazione di rango di Spearman tra foresta e D65 per tutti i recettori: p < 0.0001, r > 0.988).

La discriminazione visiva (livello di mimetismo) è stata valutata secondo il modello di discriminazione del rumore dei recettori ampiamente utilizzato da Vorobyev e Osorio24. Sulla base di una recente valutazione dettagliata delle stime del rumore recettoriale59, è stata selezionata una frazione di Weber di 0,1 per la discriminazione dei colori con rapporti di fotorecettori a cono singolo (UV, onde corte, onde medie, onde lunghe) di 1,00: 1,92: 2,68: 2,70, rispettivamente60 , mentre una frazione di Weber di 0,2 è stata utilizzata per la luminanza. Per quantificare la discriminazione, i valori JND sono stati calcolati sia per il colore che per il contrasto acromatico (luminanza). I calcoli JND per quest’ultimo si basano sui doppi coni e rappresentano quanto due spettri siano discriminabili l’uno dall’altro, assumendo che la discriminazione visiva sia limitata dal rumore del recettore24,61. Un valore JND di 1.00 è preso come soglia di discriminazione per gli uccelli, per cui JND < 1.00 indica che due oggetti non possono essere distinti anche in condizioni di visualizzazione ottimali, e come valori aumentano > 1.00 questo denota un contrasto crescente e maggiori differenze di distinguibilità62.

Creazione di obiettivi artificiali esperimento di predazione

Obiettivi falena artificiale per gli esperimenti di predazione aviaria seguito una vasta gamma di esperimenti passati utilizzando obiettivi simili basati sia su sfondi naturali o progettato per imitare le specie reali25,26,29,63. Gli obiettivi sono stati creati utilizzando le immagini multispettrali generate da fotografie di esemplari di falena del museo. Come per una serie di lavori passati, le immagini sono state convertite alle catture fotoniche previste della visione della cinciallegra azzurra, in condizioni di illuminazione D65, e poi l’output di una stampante è stato calibrato in un processo iterativo25,31,33 tale che i colori delle immagini (valori dei pixel) convergevano per corrispondere accuratamente alle falene reali in termini di visione degli uccelli quando riprodotti. La corrispondenza per ogni obiettivo stampato era un valore JND < 1.00, indicando l’indistinguibilità da una falena reale25,63. In generale, la maggior parte del lavoro precedente ha teso a, per esempio, semplicemente abbinare l’aspetto delle ali di destinazione al colore medio (in catture di fotoni) del substrato (ad esempio, corteccia di albero26,64). Il lavoro passato abbinando oggetti preda artificiale a modelli di lepidotteri ha anche teso a garantire che le partite di colore si basano su obiettivi che rientrano nella gamma di valori di cattura fotone del modello animale reale25. Il nostro lavoro segue più da vicino altri lavori recenti sulla colorazione delle farfalle63,65, che hanno utilizzato un modello di discriminazione visiva per creare corrispondenze con le farfalle reali, con corrispondenze scelte quando i colori cadevano entro 1-3 JND. Il nostro approccio è in realtà ancora più dettagliato in quanto, a differenza degli studi passati, non abbiamo creato tutti gli obiettivi per trattamento come identici e semplicemente corrispondenti a una colorazione media del modello, ma invece abbiamo incluso la variazione individuale abbinando diversi obiettivi individuali a 100 modelli unici di falena individuale (vedi sotto). Pertanto, il nostro lavoro è robusto nel tenere conto sia della variazione individuale che nell’impostare criteri rigorosi, per cui i modelli sono stati generati solo quando il colore e la luminanza corrispondevano agli esemplari reali entro 1,00 JND.

Una volta che 50 individui di ciascuna delle due morfologie (n = 100) sono stati calibrati correttamente, sono stati scalati per garantire che le loro dimensioni corrispondessero accuratamente alle falene pezzate della vita reale; con ogni ala, in media, 221 mm2 di superficie. Gli esemplari sono stati stampati utilizzando una HP LaserJet Enterprise 500 Colour M551 su carta da filtro Whatman No.1 12,5 cm incollata su carta comune A4. L’uso di carta da filtro su cui stampare gli obiettivi è stato intrapreso perché questo, a differenza della carta normale stampante, riflette la luce ultravioletta e ci ha permesso di corrispondere la riflessione UV di falene tipiche anche se l’inchiostro della stampante è incapace di stampare UV stesso63. Ali artificiali sono stati resi impermeabili utilizzando Plasti-Kote Matt Clear vernice spray acrilica, che ha permesso la trasmissione / riflessione di UV.

Un corpo commestibile è stato fatto di pasta, che ha dimostrato in vari esperimenti precedenti per essere un sicuro, commestibile, e una misura efficace dei tassi di predazione degli uccelli, anche quando attaccato a obiettivi di carta27,66. Seguendo i protocolli del passato, lo strutto e la farina semplice sono stati mescolati in un rapporto di 1:3, prima di aggiungere cinque gocce di colorante alimentare nero per i morfi carbonari, o una combinazione di circa un rosso, un blu, tre gialli e una goccia nera (s) per i morfi tipici. Il colorante alimentare bianco è stato usato per aggiungere il disegno ai corpi della tipa. La pasta è stata arrotolata in 12 × 5 × 2 mm, attaccata alle ali artificiali usando un perno da 20 mm inserito al centro del corpo di pasta, e lasciata tutta la notte nel congelatore a riposare.

La creazione dei corpi commestibili per gli obiettivi è stata in qualche modo vincolata sia dai coloranti alimentari disponibili sia dall’obiettivo di far corrispondere contemporaneamente colore e luminanza. Abbiamo calcolato, usando i metodi di cui sopra e la modellazione visiva, i contrasti di colore e luminanza di quindici corpi di pasta, di ogni morfo, contro le falene stesse e gli sfondi naturali di riposo. Per la luminanza, i risultati per i corpi alle falene sono stati: carbonaria (media JND più errore standard: 3,838 ± 0,733) e typica (3,809 ± 0,731). Per il colore, le corrispondenze sono state: carbonaria (16,106 ± 1,477) e typica (4,991 ± 0,641). I confronti dei corpi con i rispettivi sfondi naturali per la luminanza erano: carbonaria (3,773 ± 0,348) e typica (1,660 ± 0,309). Per il colore, le corrispondenze sono state: carbonaria (13,721 ± 1,328) e typica (2,783 ± 0,148). Pertanto, i risultati dimostrano una relativamente bassa distinguibilità dei corpi sia per le falene che per gli sfondi, con l’eccezione della carbonaria per il colore. Tuttavia, questa differenza è altamente improbabile che spieghi i nostri risultati di sopravvivenza per molteplici ragioni (vedi Discussione).

Esperimenti di predazione artificiale

Obiettivi artificiali di falena modellati ai sistemi visivi aviari sono stati utilizzati come proxy per le falene pezzate per determinare il tasso di sopravvivenza dei morfi attraverso un esperimento di predazione sul campo. Questo approccio è ben collaudato e segue da vicino una serie di lavori passati25,26,27,29,30,31,32,33,34,63,64,65. La raccolta dei dati è stata condotta nel giugno 2017 in coincidenza con l’emergenza della falena pezzata tra maggio e agosto 2017. Dieci località all’interno di boschi misti di latifoglie in aree poco inquinate nel sud dell’Inghilterra sono state selezionate in base alla disponibilità di licheni crostosi. In Cornovaglia, questi erano Argal Reservoir, Penryn (50°9′11ʺ N, 5°8′11ʺ W), Lady’s Wood, Truro (50°17′24.2ʺ N, 5°3′42.2ʺ W), St Clement Wood, Truro (50°17′29.2ʺ N, 5°3′16.1ʺ W), Kennall Vale, Ponsanooth (50°11′42.3ʺ N, 5°8′59.1ʺ W), e Devichoys Wood, Truro (50°15′17.5ʺ N, 5°3′23.6ʺ W). In Hampshire, Holybourne Down, Alton (51°10′46.6ʺ N, 0°56′52.3ʺ W) e Chawton Park Wood, Alton (51°7′31.1ʺ N, 1°1′52.4ʺ W) sono stati visitati. L’esperimento ha seguito un disegno a blocchi randomizzati26 di 500 campioni su dieci blocchi lungo un transetto non lineare di 1-1,5 km di lunghezza. In ogni blocco c’erano 25 repliche di ogni trattamento – 50 obiettivi in totale. Questi sono stati appuntati ad un’altezza di 1,7 m su un singolo albero possessore di licheni ad almeno 10 m di distanza l’uno dall’altro. Se un albero non aveva licheni crostosi a questa altezza, un ulteriore 1 m è stato percorso lungo il transetto fino a trovare un albero adatto, e poi l’albero successivo sarebbe stato a 10 m di distanza. Le falene sono state scelte a caso da un sacchetto, per evitare errori di selezione, e appuntate sui tronchi e sotto i rami perché queste aree hanno dimostrato di essere i luoghi naturali di riposo più frequentati dalla falena11. Gli obiettivi sono stati appuntati a orientamenti entro 20 ° del piano orizzontale come questo è naturalmente esibito comportamento in falene geometridi41 (Fig. 3). Inoltre, gli obiettivi sono stati appuntati in posizione al centro della patch lichene essere campionato. Mentre ci può essere un rischio di bias inconscio con questo e vari esperimenti precedenti simili, crediamo che le procedure qui rendono improbabile. Ogni transetto è stato controllato a tre intervalli di tempo: 6, 24 e 48 ore. Ad ogni intervallo, tutte le falene sono state visitate per determinare se si fosse verificata una predazione o un altro risultato. I risultati sono stati censurati in base al fatto che 1 rappresentava la predazione degli uccelli o censurati 0 se la falena artificiale era sopravvissuta fino a 48 ore, era scomparsa, o si era verificato un altro incidente come la predazione da parte di una lumaca (identificata da scie di bava26). La predazione degli uccelli era evidente se il bersaglio artificiale aveva strappi dal >50% del corpo19,46 e/o le ali erano completamente o parzialmente rimosse. Come sottolineato in studi passati64, il processo di registrazione degli eventi di predazione con un numero così elevato di bersagli è poco pratico, e infatti esperimenti come il nostro qui sono stati convalidati in più occasioni. Altri studi sulle prede artificiali hanno anche dedotto la predazione aviaria dai segni fatti sui corpi di argilla63. Il bosco utilizzato in questo esperimento è paragonabile a quello di altri studi, che includevano informazioni sulle specie presenti e osservati come prendendo oggetti di preda, tra cui: cince blu (Cyanistes caeruleus), cince grandi (Parus major), pettirosso europeo (Erithacus rubecula), fringuelli (Fringilla coelebs), merli (Turdus merula), e passeri domestici (Passer domesticus)32,64. Inoltre, osservazioni dirette di uccelli che attaccano le falene pezzate vive e appuntate sono state fatte in studi passati6,11.

Analisi statistica

Le statistiche di analisi delle immagini sono state effettuate utilizzando il software ad accesso aperto R (v.3.4.0)67. Un modello lineare generalizzato è stato eseguito su entrambi i colori e luminanza JNDs, con tipo di sfondo come variabile di risposta e morfologia la variabile esplicativa. I residui del modello sono stati controllati per le ipotesi di omogeneità della varianza e una distribuzione normale, per cui i dati JND colore sia per corteccia e licheni richiesto una trasformazione log per correggere skewness. Per l’esperimento sul campo, è stata eseguita un’analisi di distribuzione non parametrica (Right Censoring) utilizzando il software statistico Minitab 1868 con stima Kaplan-Meier per misurare le probabilità di sopravvivenza, insieme al confronto delle curve di sopravvivenza utilizzando il test log-rank69,70 sul fattore trattamento. È stata eseguita un’analisi non parametrica perché i dati di sopravvivenza spesso non seguono una distribuzione prestabilita. Tutti i livelli di significatività sono stati fissati a α = 0,05.

Disponibilità dei dati

I dati riportati in questo articolo sono disponibili nei dati supplementari 1.