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3. Discussione

Il DT della maggior parte dei batteri nel loro ambiente naturale non è noto. Abbiamo usato stime del tasso al quale i batteri accumulano mutazioni nel loro ambiente naturale e stime del tasso al quale mutano in laboratorio per stimare il DT per diversi batteri e dedurre la distribuzione dei DT tra i batteri. Stimiamo che i DT sono generalmente più lunghi in natura che in laboratorio, ma criticamente deduciamo anche che i DT variano di diversi ordini di grandezza tra le specie batteriche e che molti batteri hanno DT molto lenti nel loro ambiente naturale.

Il metodo, con cui abbiamo dedotto il DT in natura, fa tre ipotesi importanti. Assumiamo che il tasso di mutazione per generazione sia lo stesso in laboratorio e in natura. Tuttavia, sembra probabile che i batteri in natura avranno un tasso di mutazione per generazione più alto di quelli in laboratorio per due motivi. In primo luogo, i batteri in natura sono probabilmente stressati e ci si può aspettare che questo aumenti il tasso di mutazione. In secondo luogo, se assumiamo che i DT siano più lunghi in natura che in laboratorio, allora ci aspettiamo che il tasso di mutazione per generazione sia più alto in natura che in laboratorio, perché alcuni processi mutazionali non dipendono dalla replicazione del DNA. Il contributo relativo dei meccanismi mutazionali dipendenti dalla replicazione e indipendenti al tasso di mutazione complessivo è sconosciuto. I tassi di sostituzione sono più alti nei Firmicutes che non subiscono la sporulazione, suggerendo che la replicazione è una fonte di mutazioni in questo gruppo di batteri. Tuttavia, i tassi di accumulo delle mutazioni sembrano essere simili nelle infezioni latenti rispetto a quelle attive di Mycobacterium tuberculosis, suggerendo che le mutazioni indipendenti dalla replicazione potrebbero dominare in questo batterio.

La seconda ipotesi principale è che il tasso al quale le mutazioni si accumulano in natura sia uguale al tasso di mutazione per anno; in effetti, stiamo assumendo che tutte le mutazioni siano effettivamente neutre, almeno nell’arco di tempo in cui vengono valutate (o che alcune siano invedibili, ma la stessa proporzione sia invedibile in natura e in laboratorio). In quegli studi sul tasso di accumulo, in cui sono stati studiati separatamente, le mutazioni non sinonime si accumulano più lentamente delle mutazioni sinonime; i tassi relativi variano da 0,13 a 0,8, con una media di 0,57 (materiale supplementare elettronico, tabella S3). Non c’è alcuna correlazione tra il lasso di tempo in cui la stima è stata fatta e il rapporto tra i tassi di accumulo non sinonimi e sinonimi (r = 0,2, p = 0,53). Non abbiamo tentato di controllare la selezione perché i tassi relativi di accumulo sinonimi e non sinonimi sono disponibili solo per alcune specie, e i tassi relativi variano tra le specie. Tuttavia, possiamo stimare il grado in cui una maggiore selezione contro gli accumuli non-sinonimi deleteri in natura causa la sottostima del DT come segue. Il tasso osservato al quale le mutazioni si accumulano in una stirpe batterica è

3.1

dove α è la proporzione del genoma che è non codificante e β è la proporzione di mutazioni nella sequenza codificante delle proteine che sono non-sinonime. δx è la proporzione di mutazioni della classe x (i è intergenica, s è sinonima e n è non-sinonima) che sono effettivamente neutrali. α e β sono circa 0,15 e 0,7, rispettivamente, nel nostro set di dati. Anche se c’è selezione sull’uso di codoni sinonimi in molti batteri, la selezione sembra essere debole, quindi, assumiamo che δs = 1. Questo implica, dal tasso al quale le mutazioni non sinonime si accumulano rispetto alle mutazioni sinonime, che δn = 0.6. Una recente analisi delle regioni intergeniche in diverse specie di batteri ha concluso che la selezione è più debole nelle regioni intergeniche che nei siti non sinonimi; noi, quindi, assumiamo che δi = 0,8 . Utilizzando queste stime, la selezione ci porta a sottostimare il vero tasso di mutazione all’anno in natura di circa il 27%; questo a sua volta significa che abbiamo sovrastimato il DT di circa il 37%, un effetto relativamente piccolo. Per studiare quanto questa stima sia sensibile ai parametri dell’equazione 1, abbiamo variato ciascuno di essi a turno (materiale supplementare elettronico, tabella S4). Troviamo che il tasso di mutazione osservato è più sensibile alla selezione sull’uso dei codoni sinonimi, perché se c’è selezione sull’uso dei codoni sinonimi questo influenza anche le nostre stime di selezione nei siti non sinonimi e nell’intergenico. Per esempio, se la selezione sull’uso dei codoni sinonimi deprimesse il tasso di accumulo sinonimi di 0,5, questo porterebbe a una sottostima del tasso di mutazione del 63%, che a sua volta avrebbe portato a una sovrastima di 2,7 volte del DT.

Infine, anche se ogni studio ha cercato di rimuovere i polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) che erano sorti per ricombinazione, è possibile che alcuni siano ancora presenti nei dati. Gli SNP ricombinanti possono avere due effetti. In primo luogo, se si sono ricombinati dall’esterno del clade, gonfiano la stima del tasso di accumulazione e quindi portano a una sottostima del DT. In secondo luogo, se c’è ricombinazione all’interno di un clade, influenzano la filogenesi e potenzialmente portano a stimare la radice dell’albero come più giovane di quanto dovrebbe essere. Questo porterà ad una sovrastima del DT.

È importante capire che il nostro metodo stima un DT medio all’interno di un particolare ambiente in cui i batteri sono stati campionati. Il batterio può attraversare periodi di quiescenza intervallati da periodi di crescita.

Nonostante le ipotesi che abbiamo fatto nel nostro metodo, la nostra stima del DT di Pseudomonas aruginosa di 2,3 h in un paziente FC è molto simile a quello stimato indipendentemente utilizzando il contenuto ribosomiale delle cellule tra 1,9 e 2,4 h . Ci sono anche prove indipendenti che ci sono alcuni batteri che si dividono lentamente nel loro ambiente naturale. Il simbionte afide Buchnera aphidicola è stimato raddoppiare ogni 175-292 h nel suo ospite, e Mycobacterium leprae raddoppia ogni 300-600 h sulle pedane dei topi, non il suo ambiente naturale, ma uno che è probabilmente simile alla pelle umana. Inoltre, in un recente esperimento di selezione, Avrani et al. hanno scoperto che diverse popolazioni di E. coli, che erano affamate di risorse, hanno accumulato mutazioni nel gene della RNA polimerasi centrale. Queste mutazioni hanno fatto sì che questi ceppi si dividessero più lentamente dei ceppi non mutati quando le risorse erano abbondanti. È interessante notare che queste stesse mutazioni si trovano ad alta frequenza nei batteri non coltivabili, suggerendo che c’è una classe di batteri a crescita lenta nell’ambiente che sono adattati alla fame.

Korem et al. hanno recentemente proposto un metodo generale con cui il DT può essere potenzialmente stimato. Essi notano che le cellule batteriche che replicano attivamente hanno due o più copie del cromosoma vicino all’origine della replicazione, ma solo una copia vicino al termine, se la divisione cellulare avviene rapidamente dopo il completamento della replicazione del DNA. Usando il sequenziamento di prossima generazione, dimostrano che è possibile testare questo segnale e che il rapporto tra la profondità di sequenziamento vicino all’origine e alla terminazione è correlato ai tassi di crescita batterica in vivo. Brown et al. hanno esteso il metodo ai batteri senza un genoma di riferimento e/o a quelli senza un’origine e una terminazione nota della replicazione. In linea di principio, queste misure di cellule che eseguono la replicazione del DNA potrebbero essere utilizzate per stimare il DT dei batteri in natura. Tuttavia, non è chiaro come o se i metodi possono essere calibrati. Sia Korem et al. (2015) che Brown et al. (2016) trovano che le loro misure di replicazione hanno una mediana di circa 1,3 attraverso i batteri nell’intestino umano. Tuttavia, un valore di 1,3 si traduce in diversi valori relativi e assoluti del DT nei due studi. Brown et al. mostrano che la loro misura di replicazione, iRep, è altamente correlata alla misura di Korem et al., PTR, per i dati di Lactobacillus gasseri; l’equazione che mette in relazione le due statistiche è iRep = -0,75 + 2 PTR. Quindi, quando PTR = 1,3, iRep = 1,85 e quando iRep = 1,3, PTR = 1,03. I due metodi non sono coerenti. Essi producono anche stime molto diverse per il DT assoluto. Korem et al. mostrano che PTR è altamente correlato al tasso di crescita di E. coli cresciuto in un chemostato. Se assumiamo che la relazione tra PTR e tasso di crescita sia la stessa tra i batteri in vivo e in vitro, allora questo implica che il DT mediano per il microbioma umano è di circa 2,5 ore. Al contrario, Brown et al. stimano che il tasso di crescita di Klebsiella oxytoca sia di 19,7 ore in un bambino appena nato usando la conta delle feci e trovano che questa popolazione ha un valore iRep di circa 1,77. Questo valore è maggiore della stragrande maggioranza dei batteri nel microbioma umano e dei batteri nella Candidate Phyla Radiation, suggerendo che la maggior parte dei batteri in queste due comunità si replicano molto lentamente. Queste discrepanze tra i due metodi suggeriscono che potrebbe non essere facile calibrare i metodi PTR e iRep per produrre stime del DT tra i batteri.

Infine, come dovremmo interpretare i nostri risultati per le cinque specie focali nel contesto di ciò che è noto della loro ecologia? Vibrio cholerae mostra il DT più breve di 1,1 ore. Le specie di Vibrio sono onnipresenti negli ambienti estuarini e marini. Sono noti per avere tempi di generazione molto brevi in cultura, il più breve è Vibrio natriegens di soli 9,8 minuti. In natura possono sfruttare una vasta gamma di fonti di carbonio ed energia, e come tali sono stati definiti “opportunitrofi”. Le comunità naturali di Vibrio non crescono continuamente ad un tasso accelerato, ma possono esistere per lunghi periodi in uno stato semi-dormiente punteggiato da rapidi impulsi di alti tassi di crescita, o fioriture, quando le condizioni sono favorevoli. È stato anche sostenuto che l’insolita divisione dei genomi di Vibrio in due cromosomi facilita una crescita più rapida. Indicando un DT molto breve in V. cholerae, la nostra analisi è, quindi, coerente con ciò che è noto dell’ecologia di questa specie.

Staphylococcus aureus si trova prevalentemente su animali ed esseri umani e abita varie parti del corpo, compresa la pelle e il tratto respiratorio superiore. Può causare l’infezione della pelle e dei tessuti molli così come la batteriemia. Staphylococcus aureus esibisce una gamma di modalità di crescita, alcune delle quali possono permettergli di sopravvivere allo stress e agli antimicrobici mentre nel suo ospite. Per esempio, piccole sottopopolazioni possono adottare uno stile di vita a crescita lenta e quasi dormiente, sia in un biofilm multicellulare che come piccole varianti di colonia (SCV) o cellule persister. Il nostro breve DT di 1,8 ore suggerisce che questo non è lo stato tipico di S. aureus in natura, il che non è sorprendente considerando che l’incidenza delle SCV nei campioni clinici è abbastanza bassa, tra l’1 e il 30%.

Pseudomonas aeruginosa può abitare un’ampia varietà di ambienti, tra cui suolo, acqua, piante e animali. Come le altre nostre specie focali, è un patogeno opportunista e può anche infettare gli esseri umani, specialmente quelli con un sistema immunitario compromesso, come i pazienti con FC. In questo contesto l’infezione è cronica. L’evoluzione parallela, la regolazione differenziale dei geni che gli permettono di eludere il sistema immunitario dell’ospite e di resistere al trattamento antibiotico durante l’infezione, e l’evidenza della selezione positiva suggeriscono che P. aeruginosa può adattarsi ai polmoni degli individui con FC per la sua sopravvivenza a lungo termine. È noto che cresce attivamente nell’espettorato, dove utilizza il nutrimento disponibile che supporta la sua crescita fino ad alte densità di popolazione. La sua capacità di adattarsi e di crescere attivamente nell’espettorato della FC è coerente con il suo DT relativamente breve di 2,3 ore, soprattutto considerando che questo è l’ambiente in cui è stato misurato il tasso di accumulo e corrisponde a quello stimato da Yang et al.

Escherichia coli e S. enterica risiedono principalmente nell’intestino inferiore di uomini e animali, ma possono anche sopravvivere nell’ambiente. Sebbene E. coli sia comunemente recuperato da campioni ambientali, non si pensa che sia in grado di crescere o sopravvivere per periodi prolungati al di fuori dell’intestino di animali a sangue caldo, tranne che nelle regioni tropicali dove le condizioni sono più favorevoli, anche se alcuni ceppi filogeneticamente distinti sembrano riprodursi e sopravvivere bene nell’ambiente. Al contrario, Salmonella è anche un colonizzatore enterico di animali a sangue freddo, in particolare rettili, è meglio adattato di E. coli a sopravvivere e crescere in nicchie ambientali. Per esempio, Salmonella può sopravvivere e crescere per almeno un anno nel suolo, mentre E. coli può sopravvivere solo per pochi giorni. Anche se queste nicchie secondarie possono giocare un ruolo maggiore nella Salmonella che nell’E. coli, resta il fatto che i tassi di crescita nell’ambiente saranno molto più bassi di quelli in un intestino. Pertanto, la maggiore tenacia di Salmonella in ambienti non ospitanti rispetto a E. coli potrebbe contribuire a spiegare il DT più lento in questa specie.

In sintesi, la disponibilità di stime di accumulo e di tasso di mutazione ci permette di dedurre il DT per i batteri in natura, e la distribuzione dei DT selvatici tra le specie batteriche. Queste stime del DT sono probabilmente sottostimate perché il tasso di mutazione per generazione dovrebbe essere più alto in natura che in laboratorio, e alcune mutazioni non sono generate dalla replicazione del DNA. La nostra analisi, quindi, suggerisce che i DT in natura sono tipicamente più lunghi di quelli in laboratorio, che variano notevolmente tra le specie batteriche e che una proporzione sostanziale di specie ha DT molto lunghi in natura.