Primer (biologia molecolare)

I primer sintetici sono oligonucleotidi sintetizzati chimicamente, di solito di DNA, che possono essere personalizzati per annebbiarsi in un sito specifico sul DNA modello. In soluzione, il primer si ibrida spontaneamente con il modello attraverso l’accoppiamento di base Watson-Crick prima di essere esteso dalla DNA polimerasi. La capacità di creare e personalizzare primer sintetici si è dimostrata uno strumento inestimabile necessario per una varietà di approcci biologici molecolari che coinvolgono l’analisi del DNA. Sia il metodo di terminazione a catena Sanger che il metodo “Next-Gen” di sequenziamento del DNA richiedono primer per avviare la reazione.

PCR primer designEdit

La reazione a catena della polimerasi (PCR) utilizza una coppia di primer personalizzati per dirigere l’allungamento del DNA uno verso l’altro alle estremità opposte della sequenza da amplificare. Questi primer sono tipicamente tra le 18 e le 24 basi di lunghezza, e devono codificare solo i siti specifici a monte e a valle della sequenza da amplificare. Un primer che può legarsi a più regioni lungo il DNA le amplificherà tutte, eliminando lo scopo della PCR.

Alcuni criteri devono essere presi in considerazione quando si progetta una coppia di primer PCR. Le coppie di primer dovrebbero avere temperature di fusione simili, poiché l’annealing durante la PCR avviene per entrambi i filamenti simultaneamente, e questa temperatura di fusione condivisa non deve essere né troppo più alta né troppo più bassa della temperatura di annealing della reazione. Un primer con una Tm (temperatura di fusione) troppo alta rispetto alla temperatura di annealing della reazione può disibirsi ed estendersi in una posizione non corretta lungo la sequenza del DNA. Una Tm significativamente più bassa della temperatura di annealing potrebbe non riuscire ad annebbiarsi ed estendersi affatto.

Inoltre, le sequenze di primer devono essere scelte per selezionare in modo unico una regione di DNA, evitando la possibilità di ibridazione con una sequenza simile nelle vicinanze. Un metodo comunemente usato per selezionare un sito di primer è la ricerca BLAST, che permette di vedere tutte le possibili regioni a cui un primer può legarsi. Sia la sequenza nucleotidica che il primer stesso possono essere ricercati con BLAST. Lo strumento gratuito NCBI Primer-BLAST integra la progettazione del primer e la ricerca BLAST in un’unica applicazione, così come i prodotti software commerciali come ePrime e Beacon Designer. Le simulazioni al computer dei risultati teorici della PCR (Electronic PCR) possono essere eseguite per assistere nella progettazione dei primer dando le temperature di fusione e di annealing, ecc.

Molti strumenti online sono disponibili gratuitamente per la progettazione dei primer, alcuni dei quali si concentrano su applicazioni specifiche della PCR. I popolari strumenti Primer3Plus e PrimerQuest possono essere usati per trovare primer che corrispondono a un’ampia varietà di specifiche. Primer altamente degenerati per il targeting di un’ampia varietà di modelli di DNA possono essere progettati in modo interattivo utilizzando GeneFISHER. Primer con alta specificità per un sottoinsieme di modelli di DNA in presenza di molte varianti simili possono essere progettati utilizzando DECIPHER. La progettazione dei primer mira a generare un equilibrio tra specificità ed efficienza di amplificazione.

Selezionare una regione specifica del DNA per il legame del primer richiede alcune considerazioni aggiuntive. Le regioni ricche di ripetizioni mononucleotidiche e dinucleotidiche dovrebbero essere evitate, in quanto la formazione di loop può verificarsi e contribuire alla disibridazione. I primer non dovrebbero annealarsi facilmente con altri primer nella miscela; questo fenomeno può portare alla produzione di prodotti ‘primer dimer’ che contaminano la soluzione finale. I primer non dovrebbero anche annealarsi fortemente a se stessi, poiché le forcine interne e i loop potrebbero ostacolare l’annealing con il DNA modello.

Quando si progettano i primer, basi nucleotidiche aggiuntive possono essere aggiunte alle estremità posteriori di ogni primer, ottenendo una sequenza personalizzata di cap su ogni estremità della regione amplificata. Un’applicazione di questa pratica è per l’uso nel clonaggio TA, una speciale tecnica di subclonaggio simile alla PCR, dove l’efficienza può essere aumentata aggiungendo code AG alle estremità 5′ e 3′.

Primer degeneratiModifica

Alcune situazioni possono richiedere l’uso di primer degenerati. Si tratta di miscele di primer che sono simili, ma non identici. Questi possono essere convenienti quando si amplifica lo stesso gene da organismi diversi, poiché le sequenze sono probabilmente simili ma non identiche. Questa tecnica è utile perché il codice genetico stesso è degenerato, cioè diversi codoni diversi possono codificare lo stesso amminoacido. Questo permette a diversi organismi di avere una sequenza genetica significativamente diversa che codifica per una proteina molto simile. Per questo motivo, i primer degenerati vengono utilizzati anche quando la progettazione dei primer si basa sulla sequenza proteica, poiché la sequenza specifica dei codoni non è nota. Pertanto, la sequenza del primer corrispondente all’aminoacido isoleucina potrebbe essere “ATH”, dove A sta per adenina, T per timina, e H per adenina, timina o citosina, secondo il codice genetico per ogni codone, utilizzando i simboli IUPAC per le basi degenerate. I primer degenerati possono non ibridarsi perfettamente con una sequenza bersaglio, il che può ridurre notevolmente la specificità dell’amplificazione PCR.

I primer degenerati sono ampiamente utilizzati ed estremamente utili nel campo dell’ecologia microbica. Permettono l’amplificazione di geni da microrganismi finora non coltivati o permettono il recupero di geni da organismi in cui non sono disponibili informazioni genomiche. Di solito, i primer degenerati sono progettati allineando le sequenze di geni trovati in GenBank. Le differenze tra le sequenze sono tenute in considerazione utilizzando le degenerazioni IUPAC per le singole basi. I primer PCR sono poi sintetizzati come una miscela di primer corrispondenti a tutte le permutazioni della sequenza di codoni.