寒天について
寒天の紹介
独特の匂いがあるので、実験室でよく見かける他の材料と簡単に見分けることができます。 化学的には、ガラクトースという糖のサブユニットからなるポリマーで、東アジアやカリフォルニアで採取される数種類の紅藻類の細胞壁に含まれています。 沸騰したお湯に溶かして冷やすと、実験用の寒天はゼラチン状になります。 寒天の主な用途は微生物、特にバクテリアの培地であるが、あまり知られていない用途として、スープやソースの増粘剤、ゼリーやアイスクリームの増粘剤、化粧品、飲料の清澄化、布地の糊付けなどがある(1)。 寒天はゼラチンと違って細菌に分解されないからです。 また、寒天はゼラチンよりも硬くて丈夫です。 しかし、寒天が手に入らない場合は、ゼラチンを細菌の培地として使用することも可能です。(2)
Difcoの& BBLマニュアルには、寒天の詳細や使用方法が記載されています：(3)
寒天は、Gelidium、Pterocladia、Gracilariaなどの赤紫色の海藻類（Rhodophyceae）から抽出された植物性コロイドです。 寒天の原料としてはGelidiumが好ましい。 不純物、ゴミ、ミネラル、色素は製造時に所定のレベルまで削減されます。
寒天は通常、培地を固めるために最終濃度1～2%で使用されます。 少量（0.05～0.5％）であれば、運動性の研究用の培地（0.5％w/v）や嫌気性菌（0.1％）や微好気性菌の増殖用の培地に使用されます。
学生のプロジェクトに最適な寒天
教師の監督なしに自宅で細菌を培養する学生（例えば、家の様々な場所での細菌の増殖を調査する）にとって、ある種類の細菌を他よりも優先的に増殖させないような寒天製剤を使用することが重要です。 最悪の場合、病原菌が優先的に繁殖してしまうこともあります。 そこで、プレーンタイプの栄養寒天をお勧めします。 すぐに使える栄養寒天入りのペトリ皿は、Carolina Biological社から直接購入できます。
一般的な寒天の種類
異なる種類の寒天は、異なるバクテリア株を育てるために使用されます。 一般的には、実験手順を見れば、どの種類の寒天を使うべきかがわかります。 それでもわからない場合は、先生に聞くか、Ask An Expertフォーラムに相談してください。 すべての種類の寒天が、生徒が自宅で監督なしで使用するのに適しているわけではありません。 以下のリストは、研究室で一般的に見られる寒天のいくつかの種類の概要を示しています。 これらの多くはCarolina Biological社から購入することができます。
| 寒天の種類 | 簡単な説明 | 学生の使用に適しているか？ |
|---|---|---|
| 血液寒天 | 動物（例：ヒツジ）の血液細胞を含み、ほとんどのバクテリアはこの培地で成長します。 | |
| チョコレート寒天 | ヘモフィルスの成長に必要なXとVの因子を提供する羊の血液で構成されており、ヘモフィルス種やナイセリアなどの潔癖性の生物の培養に使用される栄養培地です。 しかし、チョコレート寒天では溶血のデータが得られないため、Haemophilusのメンバーの種の区別は別の方法で行う必要があります。 | 人との接触による汚染の可能性があるため、使用しません。 |
| LB (Luria Bertani) Agar | 栄養寒天のサブタイプで、微生物学研究のための一般的な培地であり、特に潔癖ではない微生物の日常的な培養に使用することができます。 | Yes. |
| MacConkey Agar | グラム陰性菌のみが生育可能な寒天です。 さらに、大腸菌はpHインジケーターが存在するため、赤いコロニーに成長します。 なお、マックコンキー寒天パウダーには、糖類である乳糖が含まれているものと、糖類が含まれていないものがあります。 大腸菌は糖を発酵させて酸に変えるので（だから赤い色になる）、この無糖のMacConkey寒天に様々な種類の糖を加えて、赤いコロニーができるかどうかを確認することができます。 | |
| Miller’s LB Agar | この一般的なLB寒天のバリエーションは、LBと同じ成分を異なる割合で含んでいるように見えます。 | |
| ネオマイシン寒天 | クリームや軟膏、点眼薬など多くの薬に含まれている抗生物質ネオマイシンを含んでいます。 ネオマイシンは、1949年に微生物学者のセルマン・ワクスマンによって発見され、ストレプトミセス・フラディアエという細菌によって自然に生成されます。 さらに、ネオマイシンは幅広い効果を持ち、グラム陽性菌とグラム陰性菌の両方を殺すことができる。 ヒトに対しては比較的毒性が強く、アレルギー反応を起こす人もいる。 生物を嫌気的に培養する際には、ネオマイシン寒天を使用することが多い。 ネオマイシンはグラム陰性桿菌やブドウ球菌の成長を止め、ストレプトコッカス種がより豊かに成長することを可能にします。 | 安全上の懸念から使用しません |
| 非栄養寒天 | 通常、細菌の培養には適していません。 | |
| Non-Nutrient Agar | 最も多くの種類の微生物、つまり真菌やバクテリアを育てます。 しかし、すべてのバクテリアがこの上で成長できるわけではありません。 豊かすぎると感じるものもあれば、不足していると感じるものもあります。 | |
| Sabouraud Agar | 真菌類に使用され、ほとんどの細菌を死滅させる低いpHを持っています。 また、アミノグリコシド系の抗生物質であるゲンタマイシンを含んでいます。 | |
| Thayer-Martin Agar | 淋病の原因となるグラム陰性菌の一種であるNeisseria gonorrhoeae（「淋菌」とも呼ばれる）を分離するために設計されたチョコレート寒天です。 | |
| トリプティック・ソイ・アガー | 多くの種類の微生物の培養に使用される基本的な培地です。 | |
| XLD Agar | Xylose lysine deoxycholate agar。 便サンプルの培養に使用され、2つの指標が含まれています。 グラム陽性菌を抑制し、グラム陰性菌の生育を促すように配合されています。 乳糖発酵菌のコロニーは黄色に見えます。 | 選択性があるため、ありません。 |
Preparing Bottled Agar and Plates(5)
Pre-experiment:
滅菌したペトリ皿は、寒天を注ぐ準備ができるまで閉じておきます。 空気中の汚染物質は、開いたペトリ皿に容易に侵入します。
事前に流し込んだ寒天プレートもありますが、いくつかの簡単な手順に従うことで、タブレット、粉末、またはボトル入りの寒天から寒天プレートを作ることができます。 通常、寒天キットには、プレートの作成方法が詳しく説明されていますが、以下に手順の例を示します。 疑問がある場合は、必ず説明書をよく読み、必要に応じて助けを求めてください（先生に相談するか、寒天キット販売会社のテクニカル・ヘルプ・ラインに電話してください）。
錠剤または粉末状の寒天の準備。
LB（Luria Bertani）寒天の処方は、9.1g/Lトリプトン、4.6g/L酵母エキス、4.6g/L NaCl、および13.7g/L寒天です。 錠剤を使用する場合は、水500mlに対して10錠を溶かします。 粉末寒天の場合は、6.9gの寒天を500mlの水に電子レンジで溶かします。 500mlの寒天は、大きなペトリ皿（直径100mm）なら25枚、小さなペトリ皿（直径60mm）なら50枚程度になります。
ボトル入り寒天の準備：
- ボトルのキャップを緩めるが、加熱中はキャップを外さない。
- 寒天ボトルを湯煎または電子レンジで液状になるまで温める。
- キャップを開けた後、寒天ボトルの首の部分を火に通して殺菌する。 キャップをなくさないようにしてください
- 寒天を注ぐときは、シャーレの蓋をできるだけ小さく開け、斜めにして、蓋がシャーレの真上に来るようにします。
- 溶かした寒天を、底面の1/8インチを覆うように、それぞれの無菌プラスチック製シャーレに十分注ぎます。 すぐにペトリ皿の蓋をする。
- 寒天培地をカウンタートップに置き、冷却して固める。 寒天培地は室温では硬いゼラチンのように固まります。
- キャップをかぶせる前に、もう一度寒天ボトルの首を炎に通します。
プレパラートの準備：
プレートが冷蔵保存されている場合は、出しておいて室温に戻しておく。
Storage:
寒天プレートを逆さまにして冷蔵庫に入れる。 凍らせないでください。 プレートを逆さまにする目的は、結露が寒天の表面に滴り落ち、コロニー間の生物の移動を促進するのを防ぐためです。
その他のヒントについては、http://www.umsl.edu/~microbes/pdf/tipsforplates.pdfをご覧ください。
その他の安全上の留意点（6）
- ブロス液を攪拌する際には、攪拌スケールを低めに設定し、そこから速度を上げていくことに特に注意する必要があります。
- 煮汁を加熱するときは、フラスコに蓋をして、沸騰しないように、またこぼれないようにすること。
- 煮汁を注ぐときは、やけどをしないようにシャーレに入れること。 また、この過程で重要なのは、すぐにシャーレに蓋をして、物質が比例して冷えるようにすることである。
- いったんペトリ皿を露出させたり、接種したりしたら、生徒は再び開けてはいけません。
Incubation(7)
乾燥を防ぎ、においを抑えるために、各シャーレをジップロックバッグの中に入れます。 プレートを逆さにして、暖かい場所に置く。 多くの微生物にとって、インキュベーションの理想的な温度は32℃または90°Fです。 2〜3日で細菌の増殖が目に見えるようになります。
家庭でバクテリアを育てている人（家のあちこちでバクテリアの繁殖を調べている人など）は、実験用のインキュベーターの代わりに、手作りの「電球型インキュベーター」を使ってもよいでしょう。 このページでは、”電球型インキュベーター “の作り方をご紹介します。 http://www.umsl.edu/~microbes/pdf/Incubator.pdf
廃棄(8)
ペトリ皿をテープで閉じた後は、二度と開けないでください。 また、実験中に増殖した微生物はすべて死滅させてから廃棄してください。 細菌培養物を廃棄する最良の方法は、熱安定性のあるバイオハザード・バッグに入れて加圧滅菌することです。 オートクレーブや圧力釜がない場合や、これを行うのに十分な大きさがない場合は、プレートを漂白する方法もあります。 20%または「5分の1」の家庭用漂白剤（つまり、1部の漂白剤と4部の水）でプレートを浸します。 漂白剤に一晩浸した後、廃棄してください。 なお、この漂白剤は腐食性があるので、十分に除去する必要があります。 また、焼却炉がある場合は、プレートを焼却することもできます。
Dorland, W.A.M. (2012). Dorland’s Medical Dictionary. Retrieved January 17, 2013 from http://www.dorlands.com/wsearch.jsp
University of Texas Health Science Center at Houston: http://med.uth.tmc.edu/
Endnotes
(1) “Agar plate.”. ウィキペディアに掲載されています。 http://en.wikipedia.org/wiki/Agar_plate, accessed January 14, 2005.
(2) “Microbiology”. MadSci Network. http://www.madsci.org/posts/archives/mar98/888937612.Mi.r.html、アクセスは2005年1月25日。
(3) “Agars”. Difco & BBL Manual. 2013年1月17日取得 http://www.bd.com/ds/technicalCenter/documents.asp
(4)栄養寒天のカタログ番号になります。 ノンニュートリエントアガーと書かれた写真のキャプションではなく、カタログ番号の横、下部にあるアイテムの説明に従ってください。
(5) “寒天ボトル – 準備 &http://www.sciencestuff.com/playground/agar_bottle.shtml、2005年1月14日アクセス。
(6) Mott, et al. “Artificial Environments for Growing Bacteria.”. WWバイオ研究所. http://www.woodrow.org, (www.woodrow.org/teachers/esi/2002/Biology/Projects/lab_skills/ls5/), accessed January 14, 2005.
（7）”寒天ボトル-準備 &http://www.sciencestuff.com/playground/agar_bottle.shtml、2005年1月14日アクセス。