プライマー（分子生物学）
合成プライマーは化学的に合成されたオリゴヌクレオチドで，通常はDNAからできており，鋳型DNAの特定の部位にアニールするようにカスタマイズすることができます。 溶液中では、プライマーはワトソン-クリック塩基対を介してテンプレートと自然にハイブリダイズした後、DNAポリメラーゼによって伸長される。 合成プライマーの作成とカスタマイズは、DNAの分析を伴うさまざまな分子生物学的アプローチに必要な貴重なツールであることが証明されている。
PCR primer designEdit
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)では、一対のカスタムプライマーを使用して、増幅される配列の反対側の端で、互いにDNAの伸長を誘導します。 プライマーの長さは通常18～24塩基で、増幅される塩基配列の上流側と下流側の特定の部位のみをコードする必要があります。
PCR用プライマーのペアを設計する際には、いくつかの基準を考慮する必要があります。 PCRのアニーリングは両鎖同時に行われるため、一対のプライマーは同じような融解温度を持ち、その融解温度が反応のアニーリング温度より高すぎても低すぎてもいけません。 Tm（融解温度）が反応のアニーリング温度よりも高すぎるプライマーは、ミスハイブリダイゼーションを起こし、DNA配列の誤った位置に伸長する可能性がある。
さらに、プライマーの配列は、DNAのある領域を独自に選択し、近くの類似した配列にハイブリダイズする可能性を避けるために選択する必要があります。 プライマーサイトを選択する方法としては、BLAST検索が一般的で、プライマーが結合する可能性のある領域をすべて見ることができます。 これにより、プライマーが結合する可能性のあるすべての領域を見ることができる。ヌクレオチド配列とプライマー自体の両方をBLAST検索することができる。 NCBIの無償ツールであるPrimer-BLASTは、プライマー設計とBLAST検索を1つのアプリケーションに統合しており、ePrimeやBeacon Designerなどの商用ソフトウェア製品もあります。
多くのオンラインツールがプライマー設計のために自由に利用でき、その中にはPCRの特定のアプリケーションに焦点を当てたものもあります。
プライマー設計のための多くのオンラインツールが自由に利用できます。 また、GeneFISHERでは、多様なDNAテンプレートをターゲットとする高変性プライマーをインタラクティブに設計することができる。 また、DECIPHERを用いて、多くの類似した変異体が存在する中で、一部のDNAテンプレートに対して高い特異性を持つプライマーを設計することができる。
プライマー結合のためにDNAの特定の領域を選択するには、いくつかの追加的な検討が必要です。 モノヌクレオチドやジヌクレオチドのリピートが多い領域は、ループ形成が起こり、ミスハイブリダイゼーションの原因となるため、避けるべきです。 プライマーは、混合物中の他のプライマーと容易にアニーリングしてはならない。この現象は、最終溶液を汚染する「プライマーダイマー」生成物の原因となる。
プライマーを設計する際、各プライマーの後端に追加のヌクレオチド塩基を加えることで、増幅領域の各末端にカスタマイズされたキャップ配列を作ることができます。
Degenerate primersEdit
状況によっては縮退プライマーの使用が必要な場合があります。 縮退プライマーとは、類似しているが同一ではないプライマーの混合物です。 これは、異なる生物から同じ遺伝子を増幅する際に、配列が似ていても同一ではないので便利です。 この技術が有用なのは、遺伝暗号自体が縮退しているため、複数の異なるコドンが同じアミノ酸をコードすることができるからである。 このため、異なる生物では、非常に類似したタンパク質をコードする遺伝子配列が大きく異なることがある。 このため、タンパク質の塩基配列に基づいてプライマーを設計する場合も、コドンの具体的な配列がわからないため、縮退型プライマーが用いられる。 この場合、Aはアデニン、Tはチミン、Hはアデニン、チミン、またはシトシンを意味し、それぞれのコドンの遺伝暗号に応じて、縮退塩基のIUPAC記号を用いている。
縮退プライマーは、微生物生態学の分野で広く使用されており、非常に有用である。
縮退型プライマーは、これまで未培養の微生物の遺伝子を増幅したり、ゲノム情報が得られない生物の遺伝子を復元したりすることができるため、微生物の生態学の分野で広く使われており、非常に有用です。 通常、縮退プライマーは、GenBankに登録されている遺伝子配列をアライメントして設計される。 配列の違いは、個々の塩基にIUPACの縮退を用いることで説明される。 PCRプライマーは、コドン配列のすべてのパーミュテーションに対応するプライマーの混合物として合成されます。