Alles over agar

Een inleiding tot agar

Met zijn kenmerkende geur kan men agar gemakkelijk onderscheiden van de andere materialen die men gewoonlijk in een laboratorium aantreft. Chemisch gezien is agar een polymeer dat bestaat uit subeenheden van de suiker galactose, en is een bestanddeel van de celwanden van verschillende soorten rode algen die gewoonlijk in Oost-Azië en Californië worden geoogst. Opgelost in kokend water en afgekoeld ziet laboratoriumagar er gelatineachtig uit. Hoewel agar vooral wordt gebruikt als voedingsbodem voor micro-organismen, vooral bacteriën, wordt het ook gebruikt als verdikkingsmiddel in soepen en sauzen, in gelei en ijs, in cosmetica, voor het klaren van dranken en voor het lijmen van stoffen.(1)

Men kan zich afvragen waarom agar, in tegenstelling tot gewone gelatine (zoals die in Jello), wordt gebruikt voor het kweken van bacteriën. Het antwoord is dat agar, in tegenstelling tot gelatine, niet wordt afgebroken (opgegeten) door bacteriën. Bovendien is agar steviger en sterker dan gelatine. Het is echter nog steeds mogelijk gelatine te gebruiken als kweekmedium voor bacteriën als agar niet beschikbaar is.(2)

De Difco & BBL handleiding geeft meer details over agar en het gebruik ervan:(3)

Agar is een fycocolloïd geëxtraheerd uit een groep roodpaarse zeealgen (Klasse Rhodophyceae) waaronder Gelidium, Pterocladia en Gracilaria. Gelidium is de voorkeursbron voor agars. Onzuiverheden, puin, mineralen en pigment worden tijdens de productie gereduceerd tot gespecificeerde niveaus.

Agar is een gel bij kamertemperatuur en blijft stevig bij temperaturen tot 65°C. Agar smelt bij ongeveer 85°C, een andere temperatuur dan die waarbij het stolt, 32-40°C. Deze eigenschap staat bekend als hysterese. Agar is over het algemeen bestand tegen afschuifkrachten; verschillende agars kunnen echter verschillende gelsterktes of stijfheidsgraden hebben.

Agar wordt meestal gebruikt in een eindconcentratie van 1-2% voor het stollen van cultuurmedia. Kleinere hoeveelheden (0,05-0,5%) worden gebruikt in media voor motiliteitsstudies (0,5% w/v) en voor de groei van anaeroben (0,1%) en microaerofielen.

Specificaties voor agar van bacteriologische kwaliteit zijn onder meer een goede helderheid, gecontroleerde gelatietemperatuur, gecontroleerde smelttemperatuur, goede diffusiekenmerken, afwezigheid van toxische bacterieremmers en relatieve afwezigheid van metabolisch nuttige mineralen en verbindingen.

De beste agar voor studentenprojecten

Voor studenten die thuis bacteriën kweken zonder toezicht van een leraar (bijvoorbeeld onderzoek naar bacteriegroei op verschillende plaatsen in huis), is het belangrijk een agarformulering te gebruiken die niet de ene soort bacteriën boven de andere bevoordeelt. Het ergste geval zou een agar zijn die bij voorkeur pathogene bacteriën kweekt. Daarom bevelen wij een gewone voedingsagar aan. Gebruiksklare petrischaaltjes met voedingsagar kunnen rechtstreeks bij Carolina Biological worden gekocht.

Voorkomende soorten agar

Verschillende soorten agar worden gebruikt voor het kweken van verschillende bacteriestammen. In het algemeen zal een experimentele procedure u vertellen welk type agar u moet gebruiken. Als je het nog niet zeker weet, vraag het dan aan een docent of raadpleeg ons Ask An Expert-forum. Niet alle soorten agar zijn geschikt voor leerlingen om zonder toezicht thuis te gebruiken. De volgende lijst geeft een overzicht van enkele agarsoorten die vaak in laboratoria worden gebruikt. Veel van deze agars kunnen worden gekocht bij Carolina Biological.

Soort agar	Beperkte beschrijving	Geschikt voor gebruik door studenten?
Bloed Agar	Bevat bloedcellen van een dier (b.v. een schaap); de meeste bacteriën zullen op dit medium groeien.	Nee, wegens mogelijke besmetting door menselijk contact.
Chocolade Agar	Van schapenbloed gemaakt, dat de X- en V-factoren levert die nodig zijn voor de groei van Haemophilus, is dit een voedingsbodem die wordt gebruikt bij het kweken van snelle organismen zoals Haemophilus species en Neisseria. Chocolade-agar levert echter geen hemolysegegevens op, zodat de soortendifferentiatie tussen de leden van Haemophilus op een andere manier moet worden uitgevoerd.	Nee, wegens de mogelijkheid van besmetting door menselijk contact.
LB (Luria Bertani) Agar	Een subtype van nutriënt agar, dit is het algemene medium voor microbiologisch onderzoek en kan worden gebruikt voor routinematige kweek van niet bijzonder kieskeurige micro-organismen. Ook kweekt het niet bij voorkeur één soort bacteriën boven een andere.	Ja.
MacConkey Agar	Dit is een agar waarop alleen Gram-negatieve bacteriën kunnen groeien. Bovendien zullen E.coli uitgroeien tot rode kolonies, omdat er een pH-indicator aanwezig is. Er zij op gewezen dat MacConkey agarpoeder in twee versies bestaat: één met de suiker lactose erin, en één zonder toegevoegde suikers. Aangezien E.coli suikers vergist tot zuren (vandaar de rode kleur), kan men een van de vele verschillende soorten suikers toevoegen aan deze suikervrije MacConkey agar en kijken of zich rode kolonies ontwikkelen. Als je rode kolonies krijgt, weet je dat de E.coli-stam die je gebruikt die suiker kan gebruiken.	Nee, wegens selectiviteit.
Miller’s LB Agar	Deze veelgebruikte variant van LB agar lijkt dezelfde bestanddelen te hebben als LB, alleen in andere verhoudingen.		Ja, maar het is aan te bevelen de generieke formule te gebruiken.
Neomycine Agar	Bevat het antibioticum neomycine, dat in veel medicijnen zit, zoals crèmes, zalven en oogdruppels. Neomycine werd in 1949 ontdekt door de microbioloog Selman Waksman, en het wordt op natuurlijke wijze geproduceerd door de bacterie Streptomyces fradiae. Neomycine heeft bovendien een breed werkingsspectrum en doodt zowel grampositieve als gramnegatieve bacteriën. Het is relatief giftig voor de mens, en sommige mensen reageren er allergisch op. Vaak wordt neomycine-agar gebruikt voor het anaëroob kweken van organismen. Neomycine stopt de groei van gramnegatieve bacillen en stafylcoccen, waardoor Streptococcus-soorten overvloediger kunnen groeien.	Nee, om veiligheidsredenen.
Niet-voedende agar	Zo goed als niet geschikt voor het kweken van bacteriën. Kan echter wel gebruikt worden voor het kweken van andere micro-organismen.	Nee.
Nutriënt Agar	Kweekt het grootste aantal verschillende soorten microben – schimmels en bacteriën. Toch kunnen niet alle bacteriën hierop groeien. Sommige vinden het te rijk, en andere vinden het gebrekkig. De voedingsstof hierin is runderbouillon, en enkele gistextracten.	Ja.
Sabouraud Agar	Gebruikt voor schimmels en heeft een lage pH die de meeste bacteriën zal doden. Het bevat gentamicine, een aminoglycoside-antibioticum. Gentamicine kan ook veel verschillende soorten bacteriële infecties behandelen, met name Gram-negatieve infecties.	Nee, vanwege veiligheidsoverwegingen.
Thayer-Martin Agar	Chocolade agar ontworpen om Neisseria gonorrhoeae te isoleren, ook bekend als “gonococcus,” wat een soort Gram-negatieve bacterie is die verantwoordelijk is voor de ziekte gonorrhoea.	Nee, vanwege de kans op besmetting door menselijk contact.
Tryptic Soy Agar	Een basismedium dat wordt gebruikt voor het kweken van vele soorten micro-organismen. Tryptische soja-agar wordt voornamelijk gebruikt als initieel groeimedium voor: het waarnemen van koloniemorfologie, het ontwikkelen van een reincultuur, het bereiken van voldoende groei voor verder biochemisch onderzoek, en kweekopslag.	Ja.
XLD Agar	Xylose lysine deoxycholate agar. Het wordt gebruikt voor de kweek van ontlastingmonsters, en bevat twee indicatoren. Het is zo samengesteld dat het Gram-positieve bacteriën remt, terwijl de groei van Gram-negatieve bacillen wordt aangemoedigd. De kolonies van lactosefermentoren verschijnen geel.	Nee, wegens selectiviteit.

Voorbereiding van gebottelde agar en platen(5)

Voorexperiment:

Houd steriele petrischaaltjes gesloten tot u klaar bent om er agar in te gieten. Door de lucht overgedragen contaminanten kunnen gemakkelijk een open petrischaal binnendringen.

Ofschoon voorgegoten agarplaten verkrijgbaar zijn, kan men agarplaten maken van agar in tabletvorm, in poedervorm of in flessen, door een paar eenvoudige instructies te volgen. Agar-kits bevatten meestal gedetailleerde instructies over hoe de platen moeten worden bereid, en hieronder staan voorbeelden van procedures ter referentie. Bij twijfel moet u de instructies duidelijk lezen en zo nodig om hulp vragen (raadpleeg een docent of bel de technische hulplijn van de leverancier van de agar-kits).

Bereiding van agar in tabletten of poedervorm:

De formulering voor LB (Luria Bertani) agar is: 9,1 g/L trypton, 4,6 g/L gistextract, 4,6 g/L NaCl, en 13,7 g/L agar. Indien tabletten worden gebruikt, los dan 10 tabletten op per 500 ml water. Voor agar poeders, los op door microgolf, 6,9 g agar in 500 ml water. 500 ml agar is voldoende voor ~ 25 grote petrischalen (100 mm diameter) of 50 kleine petrischalen (60 mm diameter).

Bereiding van gebottelde agar:

Draai de dop van de fles los, maar verwijder de dop niet tijdens het verwarmen.
Verwarm de agarfles in een heetwaterbad of in de magnetron tot hij vloeibaar wordt.
Haal na het openen van de dop de hals van het agarflesje door een vlam om het te steriliseren. Verlies de dop niet!
Open tijdens het gieten van de agar het deksel van de petrischaal zo weinig mogelijk, houd het schuin, en zorg ervoor dat het deksel recht boven de petrischaal wordt gehouden.
Giet genoeg gesmolten agar in elke steriele plastic petrischaal om 1/8″ van de bodem te bedekken. Dek het deksel van de petrischaal onmiddellijk af.
Plaats agar platen op een aanrecht om af te koelen en in te stellen. Agar medium zal instellen als stijve gelatine bij kamertemperatuur.
Haal de hals van de agarfles nogmaals door de vlam alvorens de dop aan te brengen.

Voorgegoten platen klaarmaken:

Als de platen in de koelkast hebben gestaan, zet ze dan uit en laat ze op kamertemperatuur komen.

Opbergen:

Staak de agarplaten ondersteboven in de koelkast. Niet invriezen! Het doel van het ondersteboven leggen van de platen is te voorkomen dat condensatie op het agaroppervlak druppelt, wat vervolgens de verplaatsing van organismen tussen kolonies zou kunnen vergemakkelijken.

Zie http://www.umsl.edu/~microbes/pdf/tipsforplates.pdf voor aanvullende tips.

Aanvullende veiligheidsoverwegingen(6)

Bij het roeren van de bouillonoplossing moet men er goed op letten dat de roerschaal op een lage stand begint en van daaruit steeds sneller wordt.
Bij het verwarmen van de bouillon moet de kolf zodanig worden afgedekt dat hij niet kan overkoken, maar dat morsen wordt voorkomen.
Bij het overgieten van de bouillon moet men erop letten de petrischaal te vullen zonder zich te verbranden. Bovendien is het bij dit proces van belang ervoor te zorgen dat de petrischaal onmiddellijk wordt afgedekt om de stof evenredig te laten afkoelen.
Als de petrischaaltjes eenmaal zijn blootgesteld of geënt, mogen de leerlingen ze niet opnieuw openen.

Incubatie(7)

Plaats elk petrischaaltje in een zakje met ritssluiting om uitdrogen te voorkomen en geurtjes tegen te gaan. Draai de schaaltjes om en zet ze op een warme plaats. Voor veel micro-organismen is de ideale temperatuur voor incubatie 32°C of 90°F. De bacteriegroei moet na 2-3 dagen zichtbaar beginnen te worden.

Wie thuis bacteriën kweekt (bijvoorbeeld om de groei van bacteriën op verschillende plaatsen in huis te onderzoeken), kan in plaats van een laboratoriumincubator een zelfgemaakte “gloeilampincubator” gebruiken. Deze pagina beschrijft hoe je een “gloeilampincubator” maakt:” http://www.umsl.edu/~microbes/pdf/Incubator.pdf

Verwijdering(8)

Als de petrischalen zijn dichtgeplakt, mogen ze niet meer worden geopend. Alle micro-organismen die tijdens het experiment zijn gekweekt, moeten worden gedood voordat ze worden weggegooid. De beste manier om bacterieculturen weg te gooien is ze onder druk te steriliseren in een hittebestendige biohazardzak. Als er geen autoclaven of snelkookpannen beschikbaar of groot genoeg zijn om dit mogelijk te maken, kunnen de platen ook worden gebleekt. Verzadig de platen met een oplossing van 20% of “1 op 5” huishoudbleekmiddel (met andere woorden, 1 deel bleekmiddel en 4 delen water). Laat ze een nacht in de bleekoplossing weken voordat u ze weggooit. Houd er rekening mee dat de bleekoplossing bijtend is en na afloop grondig moet worden verwijderd. Bovendien kunnen de platen worden verbrand als er toegang is tot een verbrandingsoven.

Dorland, W.A.M. (2012). Dorland’s Medische Woordenboek. Op 17 januari 2013 ontleend aan http://www.dorlands.com/wsearch.jsp

University of Texas Health Science Center at Houston: http://med.uth.tmc.edu/

Endnotes

(1) “Agarplaat.” Wikipedia. http://en.wikipedia.org/wiki/Agar_plate, geraadpleegd op 14 januari 2005.

(2) “Microbiologie.” MadSci Network. http://www.madsci.org/posts/archives/mar98/888937612.Mi.r.html, geraadpleegd op 25 januari 2005.

(3) “Agars.” Difco & BBL Handleiding. Op 17 januari 2013 ontleend aan http://www.bd.com/ds/technicalCenter/documents.asp

(4) Dit is het catalogusnummer voor nutriëntenagar. Volg de artikelbeschrijving onderaan, naast het catalogusnummer, en niet het bijschrift bij de foto, waar staat: non-nutrient agar.

(5) “Agar Flessen – Voorbereiding & Apparatuur Gebruik.” Science Stuff, Inc. http://www.sciencestuff.com/playground/agar_bottle.shtml, geraadpleegd op 14 januari 2005.

(6) Mott, et al. “Artificial Environments for Growing Bacteria.” WW Bio Institute. http://www.woodrow.org, (www.woodrow.org/teachers/esi/2002/Biology/Projects/lab_skills/ls5/), geraadpleegd op 14 januari 2005.

(7) “Agarflessen – Voorbereiding & Apparatuur Gebruik.” Science Stuff, Inc. http://www.sciencestuff.com/playground/agar_bottle.shtml, geraadpleegd op 14 januari 2005.