Avian vision models and field experiments determine the survival value of peppered moth camouflage

Museum collection photography

Photographs of peppered moth (Biston betularia) specimens waren nodig voor digitale beeldanalyse. Fotografische gegevens werden verkregen uit drie musea in het zuiden van Engeland: Bristol Museum and Art Gallery, de Exeter Ark van het Royal Albert Memorial Museum and Art Gallery, en het Oxford University Museum of Natural History. De Oxford-collecties zijn opmerkelijk omdat zij de specimens bevatten die door Kettlewell werden verzameld voor zijn oorspronkelijke predatie- en broedexperimenten met vogels. Er werd toegang verleend tot de laden met specimens om de meest intacte typica en carbonaria vormen van beide geslachten te selecteren voor bemonstering, waarbij de selectie gebaseerd werd op vleugelcompleetheid.

We gebruikten een Nikon D7000 DSLR camera die vooraf een kwartsconversie had ondergaan (Advanced Camera Services Limited, Norfolk, UK) door het interne UV-filter te vervangen door een transparante kwartsplaat, zoals in eerdere studies22,48. Dit maakte een volledige spectrale gevoeligheid in het gehele zichtbare spectrum van de vogels mogelijk. Er werd een CoastalOpt 105 mm UV Macro APO verwisselbare lens op bevestigd, waarbij foto’s in het zichtbare spectrum werden genomen met een Baader UV-IR blokkeringsfilter (transmissie 400-700 nm) en ultraviolet (UV) foto’s werden genomen met een Baader UV doorlaatfilter (transmissie 315-400 nm)23. Alle beelden werden in RAW-formaat genomen. Er werd een ruimte in de collecties uitgekozen met een minimale hoeveelheid natuurlijk en kunstmatig licht om de belichtingsapparatuur niet te storen, die bestond uit een Iwasaki EYE Colour Arc lamp aangesloten op een Ventronic ballast, gemonteerd op een PhotxPro fotografisch lichtstatief met een Elinchrom paraplu. De booglamp werd gedurende 15 minuten opgewarmd, zodat de lamp ten minste 90% van zijn volledige lichtopbrengst kon bereiken. Vóór gebruik werd het UV-blokkeringsfilter dat over de booglamp was aangebracht, verwijderd met een staalborstel om een volledig spectrum van golflengten mogelijk te maken. Een cilindervormig vel PTFE werd rond de lamp geplaatst, of rond het (de) te fotograferen specimen(s) indien toegankelijk, om het licht gelijkmatig te verspreiden.

In voorkomend geval werd een mot uit de specimen-lade gehaald en op een neutrale grijze schuimrubberen achtergrond geprikt. Per opname werden maximaal drie exemplaren gefotografeerd om er zeker van te zijn dat ze allemaal even groot waren en dat de vleugels niet buiten het kader vielen. Om elk effect van lichtvariaties uit te sluiten, werd een lichte (95%) en donkere (5%) reflectiestandaard (Labsphere, Congleton, UK) gebruikt, samen met een schaalbalk aan de kant die zich het dichtst bij de specimens bevindt. De camera werd recht van boven geplaatst met behulp van een kopieerstatief of een statief met een flexibele kop, en vervolgens scherpgesteld om een optimale scherpte te verkrijgen. De belichtingstijd werd gekozen naargelang met het zichtbaar of UV-filter werd gefotografeerd en werd geoptimaliseerd voor een correcte belichting en om verzadiging te voorkomen49. Een afstandsbediening werd gebruikt om onnodige ruis of beweging te minimaliseren.

Natuurlijke achtergrondcamouflage-analyse

Cryptische camouflage tussen de pepervlinder en zijn natuurlijke rustachtergrond werd onderzocht door het modelleren van het zicht van vogels om chromatische en achromatische contrasten te vergelijken. Bossen in weinig verontreinigde gebieden werden bezocht om in situ foto’s te verkrijgen van gewone boomschors en foto’s van schors met korstmossen. Eiken (Quercus robar) en essen (Fraxinus excelsior) werden geselecteerd op basis van hun geschiktheid als natuurlijke rustplaats, zoals vastgesteld in eerdere experimenten met de pepermot21,28. Selectie van korstmossen soorten, Lecidella elaeochroma en Graphis scripta, in tegenstelling tot foliose korstmossen, was gebaseerd op eerder werk 4,21,45, en omdat eerdere experimenten blijkt dat korstmossen het meest voorkomt op boomstammen en de onderkant van de hoofdtakken28, die de natuurlijke rustplaatsen meest bezocht door de pepermot11. Bewijs tegen het gebruik van foliose korstmossen wordt ondersteund door voorouderpopulaties die op de bovenste takken werden aangetroffen, terwijl korstmossen onder de takken floreren op niet-vervuilde locaties4. 130 individuele bomen werden geselecteerd volgens de eerder geschetste geschiktheid, waarbij 65 gewone schors en 65 met korstmos bedekte schorsspecimens bij neutraal licht werden gefotografeerd tijdens daglichturen, met dezelfde Nikon D7000 camera en lenzen als bij de collectie museumexemplaren.

Om de beelden voor te bereiden op analyse, werd elke foto geconverteerd naar een multispectraal beeld met behulp van de open-toegangssoftware ImageJ50 met de Image Calibration and Analysis Toolbox plugin23. Voor elk specimen werd een RAW beeld in zowel het UV als het zichtbare gebied geselecteerd, en vooraf gescreend om te controleren op overbelichting. De lichte en donkere reflectiestandaarden werden afzonderlijk geselecteerd om de kanalen te normaliseren en rekening te houden met mogelijke variatie in lichtomstandigheden49. Vervolgens werd een handmatige uitlijning uitgevoerd op de zichtbare RGB- en UV-kanalen van de 32-bit stack van de multispectrale beelden voor nauwkeurige kleurmetingen. Voor elk monster van de twee verschillende achtergrondtypes werd één enkele typica of carbonaria motmorf vergeleken door willekeurige selectie, om te bepalen hoe kleur en luminantie (lichtheid) contrasteerden tussen de mot en zijn achtergrond.

Voor het modelleren van roofvogel visie, werd de pimpelmees (Cyanistes caeruleus) geselecteerd omdat eerdere studies hebben aangetoond dat ze de pepermot aanvallen10,11, hun foerageergedrag kan worden beïnvloed door UV signalen51, en in het algemeen hun visuele systeem is representatief voor veel hogere passerine vogels19,52. We hebben eerst een beproefde methode gebruikt om gekalibreerde beelden van camera’s om te zetten in dierlijke kleurruimte (voorspelde kegelresponsgegevens) met behulp van een polynomiale karteringstechniek23,49,53 onder D65 (daglicht) lichtomstandigheden. Deze methode is zeer accuraat in het genereren van kegelresponsgegevens in vergelijking met modellering met behulp van reflectiespectra23,54,55. Hoewel we een ander stralingsspectrum hadden kunnen gebruiken (zoals een groene bosschaduw), zou dit de resultaten om verschillende redenen niet hebben beïnvloed. Ten eerste is het bos in feite geen aaneengesloten schaduw maar zijn er stukken bomen en open plekken, en dus een mengeling van open hemel en bosschaduwverlichting. Bovendien zouden echte nachtvlinders en de modellen hier daadwerkelijk worden blootgesteld aan een reeks lichtomstandigheden die verband houden met het tijdstip van de dag, de diepte van de bos/vegetatiebedekking, en het weer. Bovendien, zoals de meeste andere visuele modellering, houden we rekening met het proces van kleurstabiliteit, via de zogenaamde von Kries transformatie56,57, en als zodanig is aangetoond dat het gebruik van een ander irradiantiespectrum weinig effect heeft op de voorspelde kegelvangstwaarden57,58. Om ten slotte volledig aan te tonen dat onze modellering robuust is voor verlichting, hebben we de voorspelde kegelvangstwaarden voor 16 nachtvlinders (acht typica en acht carbonaria) vergeleken onder zowel D65 als bosschaduw instralingsspectra. Zoals verwacht waren de resultaten onveranderd, met gemiddelde plus standaardafwijking kegelvangsten als volgt: dubbele (bos = 0.22 ± 0.13, D65 = 0.21 ± 0.13), langegolf (bos = 0.27 ± 0.15, D65 = 0.27 ± 0.15), langegolf (bos = 0.21 ± 0.13).15, D65 = 0,27 ± 0,15), middengolvig (woud = 0,20 ± 0,13, D65 = 0,20 ± 0,13), kortegolvig (woud = 0,14 ± 0,10, D65 = 0,14 ± 0,10), ultraviolet (woud = 0,08 ± 0,06, D65 = 0,07 ± 0,06). In alle gevallen was er een zeer sterke en significante correlatie tussen de kegelvangstwaarden onder de twee lichtomstandigheden (Spearman’s rangcorrelatietests tussen bos en D65 voor alle receptoren: p < 0.0001, r > 0.988).

Visuele discriminatie (mate van camouflage) werd beoordeeld volgens het veelgebruikte receptor-ruis-discriminatiemodel van Vorobyev en Osorio24. Op basis van een recente gedetailleerde evaluatie van de ramingen van receptorruis59 werd een Weber-fractie van 0,1 gekozen voor kleurendiscriminatie met single cone (UV, kortegolf, middengolf, langegolf) fotoreceptor-ratio’s van respectievelijk 1,00: 1,92: 2,68: 2,7060 , terwijl voor luminantie een Weber-fractie van 0,2 werd gehanteerd. Om de discriminatie te kwantificeren, werden JND-waarden berekend voor zowel kleur als achromatisch contrast (luminantie). JND-berekeningen voor dit laatste zijn gebaseerd op dubbele kegels en geven aan hoe goed twee spectra van elkaar te onderscheiden zijn in de veronderstelling dat visuele discriminatie beperkt wordt door receptorruis24,61. Een JND-waarde van 1,00 wordt genomen als de discriminatiedrempel voor vogels, waarbij JND < 1,00 aangeeft dat twee objecten zelfs onder optimale kijkomstandigheden niet kunnen worden onderscheiden, en naarmate de waarden > 1,00 hoger worden, duidt dit op een toenemend contrast en grotere verschillen in onderscheidbaarheid62.

Creatie van kunstmatige predatie experiment doelen

Kunstmatige mot doelen voor de vogel predatie experimenten volgde een breed scala van het verleden experimenten met soortgelijke doelen gebaseerd op natuurlijke achtergronden of ontworpen om echte soorten na te bootsen25,26,29,63. Doelen werden gemaakt met behulp van de multispectrale beelden gegenereerd uit de mot museum specimen foto’s. Zoals bij een reeks eerdere werkzaamheden werden de beelden geconverteerd naar de voorspelde fotonvangsten van het zicht van de pimpelmees, onder D65 lichtomstandigheden, en vervolgens werd de output van een printer gekalibreerd in een iteratief proces25,31,33 zodanig dat de beeldkleuren (pixelwaarden) convergeerden om nauwkeurig overeen te komen met de echte motten in termen van vogelzicht wanneer ze werden gereproduceerd. De overeenkomst voor elke afgedrukte doelwit was een JND waarde < 1,00, wat aangeeft dat niet te onderscheiden van een echte mot25,63. Over het algemeen hebben de meeste eerdere werkzaamheden de neiging om, bijvoorbeeld, gewoon overeenkomen met het uiterlijk van de vleugels van het doelwit aan de gemiddelde kleur (in foton vangsten) van het substraat (bijv. boomschors26,64). Bij vroegere werkzaamheden waarbij kunstmatige prooidieren aan Lepidoptera-modellen werden gekoppeld, werd er ook meestal voor gezorgd dat de kleurovereenkomsten gebaseerd waren op doelen die binnen het bereik van fotonvangstwaarden van het echte diermodel vielen25. Ons werk sluit het nauwst aan bij ander recent werk op het gebied van vlinderkleuring63,65, waarbij een visueel-discriminatiemodel werd gebruikt om overeenkomsten met de echte vlinders tot stand te brengen, waarbij overeenkomsten werden gekozen wanneer de kleuren binnen 1-3 JND’s vielen. Onze aanpak is in feite nog gedetailleerder in die zin dat wij, in tegenstelling tot vroegere studies, niet alle doelwitten per behandeling als identiek hebben gecreëerd en eenvoudig een gemiddelde modelkleuring hebben gematcht, maar in plaats daarvan individuele variatie hebben opgenomen door verschillende individuele doelwitten te matchen met 100 unieke individuele motmodellen (zie hieronder). Daarom is ons werk robuust in het verantwoorden van zowel individuele variatie als in het stellen van strenge criteria, waarbij modellen alleen werden gegenereerd wanneer kleur en luminantie overeenkwamen met de echte exemplaren binnen 1.00 JND.

Eenmaal 50 individuen van elk van de twee morfs (n = 100) correct gekalibreerd waren, werden ze geschaald om ervoor te zorgen dat hun grootte nauwkeurig overeenkwam met echte pepermotten; met elke vleugel, gemiddeld, 221 mm2 in oppervlakte. De specimens werden afgedrukt met een HP LaserJet Enterprise 500 Colour M551 op Whatman filtreerpapier nr. 1 van 12,5 cm dat op gewoon A4-papier werd geplakt. De targets werden op filtreerpapier afgedrukt omdat dit, in tegenstelling tot normaal printerpapier, ultraviolet licht reflecteert en ons in staat stelde de UV-reflectie van typische motten te evenaren, ook al is printerinkt zelf niet in staat UV af te drukken63. Kunstmatige vleugels werden waterdicht gemaakt met Plasti-Kote Matt Clear Acrylic spuitverf, die transmissie / reflectie van UV mogelijk maakte.

Een eetbaar lichaam werd gemaakt van deeg, waarvan in verschillende eerdere experimenten is aangetoond dat het een veilige, eetbare en een effectieve maat is voor de mate van predatie door vogels, ook wanneer het aan papieren doelen is bevestigd27,66. Volgens de protocollen uit het verleden werden reuzel en gewone bloem gemengd in een verhouding van 1:3, waarna vijf druppels zwarte voedingskleurstof werden toegevoegd voor de carbonaria-morfonen, of een combinatie van ongeveer één rode, één blauwe, drie gele en één zwarte druppel(s) voor de typische morfonen. Witte levensmiddelenkleurstof werd gebruikt om de typica-lichamen een patroon te geven. Het deeg werd gerold in 12 × 5 × 2 mm lichamen, bevestigd aan de kunstvleugels met behulp van een 20-mm pennetje in het midden van het deeglichaam, en een nacht in de vriezer gelegd om te harden.

Het maken van de eetbare lichamen voor de doelen werd enigszins beperkt door zowel de beschikbare kleurstoffen als het streven om zowel kleur als luminantie gelijktijdig te laten overeenkomen. We berekenden, gebruik makend van de bovengenoemde methoden en visuele modellering, de kleur- en luminantiecontrasten van vijftien deeglichamen, van elke morf, tegen de motten zelf en natuurlijke rustende achtergronden. Voor luminantie waren de resultaten voor lichamen tegen motten: carbonaria (gemiddelde JND plus standaardfout: 3,838 ± 0,733) en typica (3,809 ± 0,731). Voor kleur waren de overeenkomsten: carbonaria (16,106 ± 1,477) en typica (4,991 ± 0,641). De vergelijkingen van de lichamen met de respectieve natuurlijke achtergronden voor luminantie waren: carbonaria (3,773 ± 0,348) en typica (1,660 ± 0,309). Voor kleur waren de overeenkomsten: carbonaria (13,721 ± 1,328) en typica (2,783 ± 0,148). De resultaten tonen dus een relatief lage onderscheidbaarheid van de lichamen met zowel motten als achtergronden, met uitzondering van carbonaria voor kleur.

Kunstmatige predatie-experimenten

Kunstmatige motdoelen gemodelleerd naar het visuele systeem van vogels werden gebruikt als proxy voor pepervlinders om de overlevingskans van morfologische motten te bepalen door middel van een predatie-experiment in het veld. Deze aanpak is goed getest en sluit nauw aan bij een reeks eerdere werkzaamheden25,26,27,29,30,31,32,33,34,63,64,65. De gegevens werden verzameld in juni 2017 om samen te vallen met de opkomst van de pepermot tussen mei en augustus 2017. Tien locaties in gemengde loofbossen in weinig verontreinigde gebieden in het zuiden van Engeland werden geselecteerd op basis van de beschikbaarheid van korstmossen. In Cornwall waren dit Argal Reservoir, Penryn (50°9′11ʺ N, 5°8′11ʺ W), Lady’s Wood, Truro (50°17′24.2ʺ N, 5°3′42.2ʺ W), St Clement Wood, Truro (50°17′29.2ʺ N, 5°3′16.1ʺ W), Kennall Vale, Ponsanooth (50°11′42.3ʺ N, 5°8′59.1ʺ W), en Devichoys Wood, Truro (50°15′17.5ʺ N, 5°3′23.6ʺ W). In Hampshire werden Holybourne Down, Alton (51°10′46.6ʺ N, 0°56′52.3ʺ W) en Chawton Park Wood, Alton (51°7′31.1ʺ N, 1°1′52.4ʺ W) bezocht. Het experiment volgde een gerandomiseerd blokontwerp26 van 500 monsters verdeeld over tien blokken langs een niet-lineair transect met een lengte van 1-1,5 km. In elk blok waren 25 replicaten van elke behandeling – 50 doelen in totaal. Deze werden op een hoogte van 1,7 m op een enkele korstmosbewonende boom geprikt, ten minste 10 m van elkaar verwijderd. Als een boom geen korstmossen had op deze hoogte, werd nog 1 m verder gelopen langs het transect tot een geschikte boom werd gevonden, en dan zou de volgende volgende boom 10 m uit elkaar staan. Motten werden lukraak uit een zakje geselecteerd, om selectiebias te vermijden, en op stammen en onder takken vastgepind omdat is aangetoond dat deze gebieden de natuurlijke rustplaatsen zijn die het meest door de mot worden bezocht11. De doelen werden binnen een hoek van 20° ten opzichte van het horizontale vlak vastgepind, omdat dit een natuurlijk gedrag is van geometrische motten41 (Fig. 3). Bovendien werden de doelen vastgepind in het midden van het te bemonsteren korstmosveld. Hoewel er een risico van onbewuste vertekening kan bestaan bij deze en diverse eerdere vergelijkbare experimenten, geloven wij dat de procedures hier dat onwaarschijnlijk maken. Elk transect werd gecontroleerd op drie tijdstippen: 6, 24, en 48 h. Op elk interval, alle motten werden bezocht om te bepalen of een predatie, of een ander resultaat, had plaatsgevonden. Resultaten werden gecensureerd waarbij 1 stond voor predatie door vogels of gecensureerd 0 als de kunstmatige mot 48 uur had overleefd, ontbrak, of een ander incident had plaatsgevonden zoals predatie door een slak (geïdentificeerd aan de hand van slijmsporen26). Vogelpredatie was duidelijk als het kunstmatige doelwit scheuren vertoonde van >50% van het lichaam19,46 en/of de vleugels geheel of gedeeltelijk verwijderd waren. Zoals uiteengezet in eerdere studies64, het proces van het opnemen van predatie gebeurtenissen met zo’n groot aantal doelen is onpraktisch, en inderdaad experimenten zoals de onze hier zijn gevalideerd bij meerdere gelegenheden. Andere studies over kunstmatige prooien hebben ook de predatie door vogels afgeleid uit merktekens op kleilichamen63. Het bosgebied dat voor dit experiment is gebruikt, is vergelijkbaar met dat van andere studies, die informatie bevatten over de aanwezige soorten waarvan is waargenomen dat ze prooien meenamen, waaronder: pimpelmezen (Cyanistes caeruleus), koolmezen (Parus major), roodborstjes (Erithacus rubecula), vinken (Fringilla coelebs), merels (Turdus merula) en huismussen (Passer domesticus)32,64. Verder zijn in eerdere studies directe waarnemingen gedaan van vogels die levende en opgespelde pepervlinders aanvielen.

Statistische analyse

Statistieken van de beeldanalyse werden uitgevoerd met de open-access software R (v.3.4.0)67. Een gegeneraliseerd lineair model werd uitgevoerd op zowel kleur als luminantie JND’s, met achtergrondtype als responsvariabele en morph als verklarende variabele. De residuen van het model werden gecontroleerd op de veronderstelling van homogeniteit van variantie en een normale verdeling, waarbij de kleur JND-gegevens voor zowel schors als korstmos een log-transformatie vereisten om te corrigeren voor scheefheid. Voor het veldexperiment werd een niet-parametrische distributieanalyse (rechtse censuur) uitgevoerd met gebruikmaking van Minitab Statistical Software 1868 met Kaplan-Meier-schatting om de overlevingskansen te meten, samen met een vergelijking van de overlevingskrommen met gebruikmaking van de log-rank test69,70 op de factor behandeling. Er werd een niet-parametrische analyse uitgevoerd omdat overlevingsgegevens vaak geen vooraf gespecificeerde bepaalde verdeling volgen. Alle significantieniveaus werden vastgesteld op α = 0,05.

Beschikbaarheid van gegevens

De in dit artikel gerapporteerde gegevens zijn beschikbaar in Supplementary Data 1.