BCR/ABL: from molecular mechanisms of leukemia induction to treatment of chronic myelogenous leukemia

Inhibitors of the BCR/ABL fusion protein

Aangezien bekend is dat de ontregelde tyrosinekinaseactiviteit van p210BCR/ABL de essentiële transformerende gebeurtenis in CML is, werden studies geïnitieerd die gericht waren op het remmen van deze TK-activiteit (Lugo et al., 1990; Oda et al., 1995).

Er zijn verschillende tyrosinekinaseremmers in CML-cellen geëvalueerd (Boutin, 1994; Levitzki en Gazit, 1995). De eerste die werden getest, waren geïsoleerd uit natuurlijke bronnen, zoals de antibiotica herbimycine-A, genisteïne en erbstatine, die de p210BCR/ABL TK-activiteit in vitro remmen, de groei van BCR/ABL+ cellijnen in vitro remmen en de erytroïde differentiatie van de K562 cellijn induceren (Carlo-Stella et al., 1996; Honma et al., 1989, 1990; Kawada et al., 1993; Okabe et al., 1992). Vervolgens werden synthetische verbindingen, tyrphostines, ontwikkeld en werden AG957 en AG568 geïdentificeerd die de p210BCR/ABL TK-activiteit in vitro remmen en erytroïde differentiatie en apoptose van de K562-cellijn induceren (Anafi et al., 1993). Bovendien herstelt AG957 de β1-integrine-gemedieerde adhesie van primaire CML-cellen (Bhatia et al., 1998). AG957 heeft ook een synergetisch antiproliferatief effect met de anti-fas receptor op CML progenitors (Carlo-Stella et al., 1999). De lage specificiteit voor de BCR/ABL TK-activiteit is echter een belangrijke beperking van deze TK-remmers.

STI571

In de late jaren tachtig werd een 2-fenylaminopyrimidine met specifieke tyrosinekinaseremmende activiteit tegen de bloedplaatjesafgeleide groeifactorreceptor (PDGF-R), C-kit en ABL tyrosinekinase, STI571 (voorheen CGP57148, nu Gleevec of imatinib mesylaat) geïdentificeerd (Buchdunger et al., 1996; Druker en Lydon, 2000). Net als tyrphostines werkt STI571 door binding aan de zeer geconserveerde nucleotide-binding pocket van het katalytische domein van het ABL-TK en het competitief blokkeren van de binding van ATP (Schindler et al., 2000).

Preklinische studies toonden aan dat STI571 specifiek de proliferatie van leukemische cellen remt, en de interleukine-3 (IL-3) afhankelijke groei en differentiatie van BCR/ABL+ cellijnen herstelt. De groei van CML myeloïde kolonievormende cellen wordt sterk geremd door STI571 met een minimaal effect op de groei van normale kolonies (Carroll et al., 1997; Deininger et al., 1997; Druker et al., 1996; Gambacorti-Passerini et al., 1997). Dit is het gevolg van remming van de proliferatie en in mindere mate van celdood (Holtz et al., 2002). Langdurige kweek van BM-cellen met langdurige blootstelling aan STI571 toonde een remmend effect op CML-progenitors met weinig toxiciteit voor normale cellen (Kasper et al., 1999). Echter, tot 30-40% van de Ph+ LTC-IC overleeft STI571 behandeling (Holtz et al., 2002). Bovendien resulteert remming van BCR/ABL kinase activiteit door STI571 in transcriptionele modificatie van verschillende genen die betrokken zijn bij de controle van de celcyclus, celadhesie en cytoskeletale organisatie (Deininger et al., 2000), wat leidt tot apoptotische dood van ten minste sommige Ph+ cellen. Studies bij muizen toonden een in vivo effect van STI571 tegen BCR/ABL+ cellen aan. Voortdurende blootstelling aan STI571 was echter noodzakelijk om 32DBCR/ABL-gegenereerde tumoren uit te roeien (le Coutre et al., 1999). Voor de klinische testen werd aangetoond dat STI571 een acceptabel toxiciteitsprofiel had bij dieren (Druker en Lydon, 2000).

Een fase I klinische trial met STI571 werd gestart in juni 1998 (Druker et al., 2001b). Deze studie was een dosisescalatiestudie, bedoeld om de maximaal getolereerde dosis vast te stellen bij 54 patiënten in de chronische fase van CML bij wie de IFN-α-therapie was mislukt. De resultaten zijn samengevat in tabel 1. De bijwerkingen waren minimaal, zonder dosisbeperkende toxiciteit.

De fase I-studies werden uitgebreid naar CML-patiënten in myeloïde en lymfoïde blastcrisis en patiënten met recidief of refractair Ph-positief ALL. De patiënten werden behandeld met dagelijkse doses van 300-1000 mg STI571. De resultaten zijn samengevat in tabel 2. STI571 heeft opmerkelijke single-agent activiteit in CML blast crisis en Ph-positief ALL, maar de responsen neigen niet duurzaam te zijn (Druker et al, 2001a).

De fase I werd gevolgd door een groot internationaal fase II-onderzoek tussen december 1999 en mei 2000, ter beoordeling van de veiligheid en werkzaamheid van STI571 bij interferon-refractaire en interferon-intolerante Ph-positieve CML-patiënten, evenals versnelde-fase CML-patiënten, CML in myeloïde blast-crisis, en Ph-positieve ALL-patiënten (Kantarjian et al., 2002; Sawyers et al., 2000; Talpaz et al., 2002). In deze studie werden meer dan 1000 patiënten in 27 centra in zes landen opgenomen over een periode van 6-9 maanden. De resultaten zijn samengevat in tabel 3. De studie bevestigde de resultaten van fase I en diende als basis voor de versnelde goedkeuring van STI572 door de Food and Drug Administration (FDA).

Sindsdien, een fase III-gerandomiseerd onderzoek waarbij STI571 werd vergeleken met interferon en cytarabine bij nieuw gediagnosticeerde patiënten, meer dan 1000 patiënten in een periode van zes maanden, en de gegevensverzameling is nog gaande.

Clinisch gezien heeft de meerderheid van de patiënten die hervallen na een aanvankelijke respons op STI571 reactivatie van het BCR/ABL kinase (Gorre et al., 2001). In vitro studies in muriene en humane BCR/ABL-positieve cellijnen die resistent zijn tegen STI571 hebben aangetoond dat een frequent mechanisme van resistentie tegen STI571 amplificatie en overexpressie van het BCR/ABL-gen is (le Coutre et al., 2000; Mahon et al., 2000). Overexpressie van de Pgp glycoproteïne, het product van het multidrug resistentie (MDR) gen, kan ook bijdragen aan het resistente fenotype. Bij ongeveer een derde van de patiënten die na een eerste respons hervallen, is sprake van BCR/ABL-amplificatie (Gorre et al., 2001). Interessant is dat de helft van deze patiënten puntmutaties in het ABL-kinasedomein hebben ontwikkeld die resulteren in verminderde gevoeligheid voor STI571 (Barthe et al., 2001; Gorre et al., 2001; Hochhaus et al., 2001). Ten minste één van de puntmutaties bevindt zich op een plaats waarvan voorspeld wordt dat het een contactplaats is tussen het ABL-kinase en STI571 (Gorre et al., 2001). Verscheidene puntmutaties bevinden zich op residuen die grenzen aan contactpunten, terwijl andere zich in de activeringslus van het kinase bevinden (Barthe et al., 2001; Gorre et al., 2001; Hochhaus et al., 2001). BCR/ABL mutatie of amplificatie zijn echter niet algemeen waargenomen bij patiënten met de novo STI571 resistentie en er zijn studies gaande om het mechanisme van primaire resistentie bij deze patiënten te identificeren.

De remming van ABL, PDGF receptor en c-kit receptor kinase activiteit door STI571 kan mogelijk interfereren met de normale cellulaire functie. De verwaarloosbare mate van bijwerkingen die in klinische trials met STI571 zijn waargenomen, suggereert echter dat alternatieve routes de onderdrukking van de normale ABL-, PDGF- en c-kit-kinasen kunnen compenseren.

Remmers van andere signaaltransductie-eiwitten

Farnesyltransferase-remmers (FTI)

Deze strategie is gebaseerd op de opvatting dat RAS-activering een centrale rol speelt in leukemogene transformatie door BCR/ABL (Cortez et al., 1996; Goga et al., 1995; Mandanas et al., 1993; Pendergast et al., 1993; Puil et al., 1994; Sanchez-Garcia en Martin-Zanca, 1997; Sawyers et al., 1995; Senechal et al., 1996). Remming van RAS signalering door expressie van dominant-negatief RAS, blokkering van Grb2 adaptor proteïne functie of incubatie met antisense oligonucleotiden aan p21Ras, voorkomt BCR/ABL transformatie in verschillende cellijnmodellen (Gishizky et al., 1995; Sawyers et al., 1995; Sakai et al., 1994; Skorski et al., 1994a). Ras functie is afhankelijk van de juiste subcellulaire lokalisatie aan het plasmamembraan door toevoeging van een 15-koolstof farnesylgroep aan Ras, een reactie die wordt gekatalyseerd door het enzym farnesyl proteïne transferase (FPT) (Gutierrez et al., 1989; Hancock et al., 1989; Long et al., 2001; Reiss et al., 1990; Stokoe et al., 1994). Farnesyl proteïne transferase remmers (FTI) zijn een klasse van geneesmiddelen die zijn ontwikkeld om specifiek oncogene Ras signalering en Ras-afhankelijke cellulaire transformatie te blokkeren (Gibbs et al., 1994). FTI verstoren de prenylering van Ras en zonder de juiste subcellulaire lokalisatie is Ras niet langer oncogeen (Kato et al., 1992). Verschillende studies hebben de krachtige antitumor activiteit van FTI in vitro aangetoond tegen Ras-getransformeerde muriene en humane kankercellen en in vivo tegen Ras-specifieke tumorvorming in transgene en xenograft muriene modellen (End, 1999; Gibbs et al., 1997; Kohl et al., 1993, 1994; Nagasu et al., 1995; Rowinsky et al., 1999). Er werd echter gerapporteerd dat FTI ook de groei remt van getransformeerde cellen waarin mutant Ras ontbreekt, hetgeen suggereert dat er ook andere mechanismen een rol spelen (Liu et al., 1998; Sepp-Lorenzino et al., 1995). Bijvoorbeeld, in aanwezigheid van remmende doses FTI worden sommige eiwitsubstraten alternatief geprenyleerd door het geranyl-geranyl eiwittransferase. Een alternatief geprenyleerde vorm van RhoB heeft een anti-proliferatieve werking op getransformeerde cellen (Lebowitz et al., 1997; Lebowitz and Prendergast, 1998). Dit laatste zou verantwoordelijk kunnen zijn voor het effect van FTI op de celproliferatie. Bemoedigende voorlopige studies hebben aangetoond dat FTI de in vitro proliferatie van ALL en juveniele chronische myeloïde leukemiecellen (JCML) remt (Emanuel et al., 2000). Een fase I dosis-escalatiestudie werd uitgevoerd met FTI R115777 bij 35 volwassenen met refractaire en recidiverende acute leukemieën (Karp et al., 2001). Klinische reacties traden op bij 29% van de 34 evalueerbare patiënten, waaronder twee complete remissies. De resultaten van deze studie leveren het eerste bewijs voor succesvolle remming van FT in neoplastische cellen in vivo en suggereren dat FTI een veelbelovende antileukemische modaliteit kan zijn.

Daarnaast remt SCH66336, een oraal FTI, krachtig de vorming van soft agar kolonies, vertraagde de proliferatie en sensibiliseerde BCR/ABL+ cellijnen voor apoptotische stimuli (Peters et al., 2001). Bij toediening aan muizen met BCR/ABL-geïnduceerde leukemie verhoogde SCH66336 de overleving van 4 weken (zonder therapie) tot meer dan een jaar. Wanneer SCH66336 echter werd teruggetrokken, ontwikkelden de dieren leukemie. Ook werd aangetoond dat SCH66336 in staat is de kolonievorming van primaire CML-cellen te remmen (Peters et al., 2001). Deze resultaten tonen aan dat FTI-verbindingen zeer effectief zijn als enkelvoudige agentia tegen met BCR/ABL getransformeerde hematopoiëtische cellen, waardoor FTI’s als een potentiële klinische behandeling voor door BCR/ABL geïnduceerde leukemie worden geïdentificeerd. Een andere studie meldde de werkzaamheid van SCH66336 bij de behandeling van BCR/ABL-positieve acute lymfoblastische leukemie in P190 transgene muizen (Reichert et al., 2001). Verdere preklinische dierstudies zullen de voordelen bepalen van het gebruik van FTI in combinatie met andere behandelingen, zoals tyrosinekinaseremmers, voor de behandeling van door BCR/ABL geïnduceerde leukemie.

Proteasoomremmers

Het proteasoom is een multikatalytisch protease dat in alle eukaryote cellen aanwezig is en de primaire component vormt van de eiwitafbraakroute van de cel. Door de afbraak van regulerende eiwitten (An et al., 2000; Dietrich et al., 1996; Pagano et al., 1995; Wu et al., 2000) speelt het proteasoom een sleutelrol bij de activering of onderdrukking van vele cellulaire processen, waaronder celcyclusprogressie en apoptose (Adams et al., 1999; Imajoh-Ohmi et al., 1995). In vitro en xenograftstudies in muizen hebben antitumoractiviteit van proteasoomremmers aangetoond bij een verscheidenheid van tumortypes, waaronder pancreas-, prostaat- en colonkanker, myeloom en chronische lymfocytaire leukemie (Adams, 2002; Hideshima et al., 2001; Shah et al., 2001). Verschillende studies hebben de hypothese onderzocht dat het proteasoom een rol kan spelen bij de regulering van de BCR/ABL functie. Effecten van Proteasoom remmers zoals tripeptide aldehyden, lactacystin, en PSI werden onderzocht in verschillende menselijke leukemische cellijnen. Proteasoomremming leidt tot verhoogde apoptotische sterfte en versterking van het effect van cytotoxische geneesmiddelen in een aantal myeloïde cellijnen (Dou et al., 1999; Drexler, 1997; Shinohara et al., 1996; Soligo et al., 2001). Dit proces omvat activering van caspasen, verstoring van de expressie van Bcl-2 familie-eiwitten en verminderde expressie van p210BCR/ABL. Interessant is dat proteasoomremmers eerst het niveau van p210BCR/ABL tyrosinekinase-activiteit verlagen en vervolgens het apoptotische doodsprogramma in K562-cellen activeren (Soligo et al., 2001). Deze resultaten suggereren dat inactivering van de BCR/ABL functie door proteasoom remmers essentieel is voor de inductie van apoptose in leukemische cellijnen. In primaire cellen is de gevoeligheid voor PSI in CML CD34+ progenitors driemaal hoger dan in normale progenitors. De waarneming dat getransformeerde cellen gevoeliger zijn voor blokkade van het proteasoom dan normale cellen, werd gemeld in leukemische cellen in vergelijking met normale cellen (Adams, 2002). Hoewel het exacte mechanisme voor deze differentiële gevoeligheid niet volledig wordt begrepen, kan remming van het proteasoom enkele van de veranderingen die proliferatie mogelijk maken en apoptose onderdrukken in kwaadaardige cellen ongedaan maken. De proteasoomremmer PS-341 was de eerste proteasoomremmer die in proeven bij mensen werd gebruikt. Zes klinische proeven van fase I voor PS-341 bij hematologische maligniteiten of vaste tumoren zijn voltooid of aan de gang (Papandreou et al., 2001; Stinchcombe et al, 2000), en de veiligheid en werkzaamheid van PS-341 behandeling voor refractair multipel myeloom en CLL worden getest in twee lopende fase II trials.

Immunomodulatie

Dit zal slechts kort worden besproken en we verwijzen de lezers naar uitstekende reviews die onlangs werden gepubliceerd (Apperley et al., 1998; Campbell e.a., 2001; Clark and Christmas, 2001; Claxton e.a., 2001; Dazzi e.a., 1999; Goodman e.a., 1998; Pinilla-Ibarz e.a., 2000b).

Infusie van donorlymfocyten bij CML-patiënten die na een allogene stamceltransplantatie (SCT) zijn hervallen, verhoogt het remissiepercentage op lange termijn aanzienlijk (Kolb e.a., 1995). Hoewel het mechanisme niet volledig wordt begrepen, bewijst dit dat immunoregulerende cellen specifiek leukemische progenitors en stamcellen kunnen elimineren. GVHD die met deze therapie gepaard gaat, vormt de belangrijkste beperking voor deze therapie. Selectieve depletie van donor CD8+ T-lymfocyten of transductie van donor T-lymfocyten met herpes simplex thymidine kinase gen kan clinici echter in staat stellen GVHD te controleren (Ackerman et al., 1978; Barrett et al., 1998; Giralt et al., 1995; Nimer et al., 1994; Tiberghien et al., 1994). Cocultuur van donorlymfocyten met leukemische cellen van de gastheer of leukemische dendritische cellen van CML-patiënten die antigenen presenteren kan worden uitgevoerd om CTL’s die specifiek reageren tegen CML-progenitors te genereren en uit te breiden (Choudhury et al., 1997; Faber et al., 1995; Falkenburg et al., 1993; Jiang en Barrett, 1995; Molldrem et al., 1997; Warren et al., 1998) ex vivo. De ontwikkeling van CML-vaccins is een andere waardevolle benadering. Bij deze therapie worden BCR/ABL-specifieke peptiden tot expressie gebracht op MHC-moleculen om een leukemie-specifieke CTL-respons op te wekken. Verschillende studies hebben de ontwikkeling van een specifieke immuunrespons aangetoond. Of dergelijke vaccins zullen volstaan om CML doeltreffend te behandelen valt nog te bezien (Bocchia et al., 1995, 1996; Bosch et al., 1996; Pinilla-Ibarz et al., 2000a; ten Bosch et al,

Toediening van lage of intermediaire doses IL2 na allogene SCT of ex vivo expansie van autologe NK-cellen met IL2 vóór reïnfusie verhoogt het aantal en activeert de NK-cellen in CML-patiënten en kan helpen bij het elimineren van minimaal residuele de ziekte (Robinson et al., 1996; Soiffer et al., 1994; Vey et al., 1999).