Creative Proteomics Blog

Western blot werd in 1979 geïntroduceerd door Towbin et al., en is een veelgebruikte methode voor eiwitanalyse. Het kan worden gebruikt voor kwalitatieve en semi-kwantitatieve eiwitanalyse. Voor de uitvoering van de western blot zijn er drie elementen, de scheiding van eiwitten naar grootte, het overbrengen van eiwitten op een vaste drager, en het markeren van eiwitten met primaire en secundaire antilichamen voor visualisatie.

Het principe van Western Blot
Western blot wordt uitgevoerd met behulp van polypropyleen gelelektroforese. Met SDS-PAGE kunnen eiwitmonsters worden gescheiden en overgebracht op een vaste drager, zoals nitrocellulose (NC) of polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan. De vaste drager kan het eiwit absorberen en zijn biologische activiteit ongewijzigd laten. Het overgebrachte membraan op vaste drager wordt een blot genoemd en wordt behandeld met een eiwitoplossing om de hydrofobe bindingsplaats op het membraan te blokkeren. Het membraan wordt behandeld met het antilichaam (primair antilichaam) van de doeleiwitten. Alleen de te bestuderen eiwitten kunnen zich specifiek binden aan het primaire antilichaam om een antigeen-antilichaamcomplex te vormen. Nadat het primaire antilichaam is gewassen en verwijderd, bindt alleen de positie van het doeleiwit aan het primaire antilichaam. De met primair antilichaam behandelde membranen worden na het wassen behandeld met een gelabeld secundair antilichaam. Na behandeling vormt het gelabelde secundaire antilichaam dat bindt aan het primaire antilichaam een antilichaamcomplex dat de locatie van het primaire antilichaam kan aangeven, zowel de locatie van het bestudeerde eiwit.

De procedure van Western Blot
Er zijn zes stappen betrokken bij Western Blot, waaronder monstervoorbereiding, gelelektroforese, eiwittransfer, blokkeren, incubatie van antilichamen, en detectie en visualisatie van eiwitten.
1.
1. Monstervoorbereiding.
Eiwitten kunnen uit verschillende monsters worden geëxtraheerd, zoals weefsels of cellen. Aangezien weefselmonsters een hogere mate van structuur vertonen, worden de weefsels eerst opgebroken door de mechanische uitvinding, zoals homogeniseren of soniceren. Protease- en fosfataseremmers worden gewoonlijk gebruikt om te voorkomen dat het monster bij koude temperaturen wordt verteerd. Na de eiwitextractie is het belangrijk de concentratie van de eiwitten te bepalen, waardoor de massa van de in elk putje geladen eiwitten kan worden bepaald. Voor de concentratie van eiwitten wordt vaak een spectrofotometer gebruikt.
2. Gelelektroforese.

De meest gebruikte gel is een polyacrylamidegel (PAG) en buffers geladen met natriumdodecylsulfaat (SDS). Voor western blot worden twee soorten agarosegel gebruikt: stacking gel, waarmee alle eiwitten in één band worden geconcentreerd, en separating gel, waarmee eiwitten op basis van hun molecuulgewicht van elkaar kunnen worden gescheiden. Kleinere eiwitten migreren sneller in SDS-PAGE wanneer een spanning wordt toegepast. Met PAGE kunnen eiwitten van 5 tot 2.000 kDa worden gescheiden, afhankelijk van de uniforme poriegrootte die wordt gecontroleerd door de verschillende concentratie PAG. Gewoonlijk worden scheidingsgels gemaakt in 5%, 8%, 10%, 12% of 15%. Bij de keuze van het juiste percentage van de scheidingsgel moeten we rekening houden met de grootte van de doeleiwitten. Hoe kleiner het bekende gewicht van de eiwitten is, hoe hoger het percentage gels moet zijn.
3. Eiwitten overbrengen.
Na het scheiden van eiwitten door middel van gelelektroforese, worden de eiwitten van binnen de gel overgebracht op een vast steunmembraan om de eiwitten toegankelijk te maken voor antilichaamdetectie. De belangrijkste methode voor het overbrengen van eiwitten wordt elektroblotten genoemd, waarbij gebruik wordt gemaakt van een elektrisch veld dat loodrecht op het geloppervlak staat, om eiwitten uit de gel te trekken en naar het membraan te verplaatsen. Het kan in halfdroge of natte omstandigheden worden gedaan, waarbij natte omstandigheden gewoonlijk betrouwbaarder zijn omdat de gel dan minder snel uitdroogt. Zoals in de linker figuur is aangegeven, wordt het membraan tussen het geloppervlak en het filter geplaatst. De transfersandwich wordt als volgt gemaakt: een vezelkussen (spons), filterpapier, de gel, een membraan, filterpapier, een vezelkussen (spons).

4. Blokkeren.
Blokkeren is een belangrijke stap in de western blot om te voorkomen dat antilichamen zich niet-specifiek aan het membraan binden. De meest gebruikte typische blockers zijn BSA en vetvrije droge melk. Wanneer het membraan in de verdunde oplossing van eiwitten wordt geplaatst, hechten de eiwitten zich aan alle plaatsen in het membraan waar de doeleiwitten zich niet hebben gehecht. Op deze manier kan de “ruis” in het eindproduct van de western blot worden verminderd en resulteren in duidelijker resultaten.
5. Incubatie van het antilichaam.
Na het blokkeren bindt het primaire antilichaam aan het doeleiwit wanneer het primaire antilichaam met het membraan wordt geïncubeerd. De keuze van een primair antilichaam hangt af van het aan te tonen antigeen. Het wassen van het membraan met de antilichaam-bufferoplossing is nuttig voor het minimaliseren van de achtergrond en verwijdert ongebonden antilichamen. Na het spoelen van het membraan wordt het membraan blootgesteld aan het specifieke enzym-geconjugeerde secundaire antilichaam. Bij incubatie met secundaire antilichamen kan het gelabelde secundaire antilichaam zich binden aan het primaire antilichaam dat met de doeleiwitten heeft gereageerd. Op basis van de soort van het primaire antilichaam kunnen we het geschikte secundaire antilichaam kiezen.
6. Eiwitdetectie en -visualisatie.
Een substraat reageert met het enzym dat aan het secundaire antilichaam is gebonden, waardoor een gekleurde substantie ontstaat. Hierdoor kunnen we de densitometrie en de locatie van het doeleiwit kennen. De grootte wordt benaderd door de eiwitbanden te vergelijken met de marker. Er zijn verschillende detectiesystemen beschikbaar voor eiwitvisualisatie, zoals colorimetrische detectie, chemiluminescente detectie, radioactieve detectie en fluorescente detectie. Het elektrochemiluminescentie (ECL) systeem is de meest gebruikte detectiemethode.

De western blot wordt vaak gebruikt voor kwalitatieve detectie van eiwitten en post-translationele modificaties (b.v. fosforylering). Daarnaast kan het ook worden gebruikt in de medische diagnostiek, zoals de HIV-test of BSE-test.