PMC
3. Discussie
De DT van de meeste bacteriën in hun natuurlijke omgeving is niet bekend. Wij hebben schattingen van de snelheid waarmee bacteriën in hun natuurlijke omgeving mutaties accumuleren en schattingen van de snelheid waarmee zij in het laboratorium muteren gebruikt om de DT voor verschillende bacteriën te schatten en de verdeling van DT’s over bacteriën af te leiden. We schatten dat de DT in het wild over het algemeen langer is dan in het laboratorium, maar we leiden ook kritisch af dat DT’s tussen bacteriesoorten enkele orden van grootte verschillen en dat veel bacteriën in hun natuurlijke omgeving een zeer langzame DT hebben.
De methode waarmee we de DT in het wild hebben afgeleid, berust op drie belangrijke aannamen. Wij gaan ervan uit dat de mutatiesnelheid per generatie in het laboratorium en in de natuur gelijk is. Het lijkt echter waarschijnlijk dat bacteriën in het wild een hogere mutatiesnelheid per generatie hebben dan die in het laboratorium, en wel om twee redenen. Ten eerste zullen de bacteriën in het wild waarschijnlijk onder stress staan, waardoor de mutatiesnelheid naar verwachting zal toenemen. Ten tweede, als we aannemen dat de DT’s in het wild langer zijn dan in het laboratorium, verwachten we dat de mutatiesnelheid per generatie in het wild hoger zal zijn dan in het laboratorium, omdat sommige mutatieprocessen niet afhankelijk zijn van DNA-replicatie. De relatieve bijdrage van replicatieafhankelijke en onafhankelijke mutatiemechanismen aan de totale mutatiesnelheid is onbekend. De substitutiesnelheid is hoger bij Firmicutes die geen sporulatie ondergaan, wat erop wijst dat replicatie een bron van mutaties is bij deze groep bacteriën. Bij Mycobacterium tuberculosis lijken de mutatieaccumulatiecijfers echter vergelijkbaar te zijn bij latente versus actieve infecties, wat suggereert dat replicatie-onafhankelijke mutaties bij deze bacterie domineren.
De tweede belangrijke aanname is dat de snelheid waarmee mutaties in het wild accumuleren gelijk is aan de mutatiesnelheid per jaar; in feite gaan we ervan uit dat alle mutaties effectief neutraal zijn, althans gedurende het tijdsbestek waarin ze worden onderzocht (of dat sommige inviraal zijn, maar dat hetzelfde percentage inviraal is in het wild en in het laboratorium). In de accumulatiesnelheidsstudies, waarin zij afzonderlijk zijn bestudeerd, accumuleren niet-synonieme mutaties langzamer dan synonieme mutaties; de relatieve snelheden variëren van 0,13 tot 0,8, met een gemiddelde van 0,57 (elektronisch aanvullend materiaal, tabel S3). Er is geen correlatie tussen het tijdsbestek waarover de schatting werd gemaakt en de verhouding tussen niet-synonieme en synonieme accumulatiecijfers (r = 0.2, p = 0.53). Wij hebben niet getracht selectie te controleren omdat de relatieve accumulatiesnelheden van synoniemen en niet-synoniemen slechts voor enkele soorten beschikbaar zijn, en de relatieve snelheden van soort tot soort verschillen. De mate waarin meer selectie tegen deleterieuze niet-synonieme accumulaties in het wild tot een onderschatting van de DT leidt, kunnen we echter als volgt schatten. De waargenomen snelheid waarmee mutaties in een bacteriële lijn accumuleren is
waarbij α het aandeel van het genoom is dat niet coderend is en β het aandeel van mutaties in eiwitcoderende sequentie dat niet-synoniem is. δx is het aandeel van mutaties van klasse x (i is intergenic, s is synoniem en n is niet-synoniem) die effectief neutraal zijn. α en β zijn in onze dataset respectievelijk ongeveer 0.15 en 0.7. Hoewel er in veel bacteriën selectie is op het gebruik van synonieme codons, lijkt die selectie zwak te zijn en daarom nemen we aan dat δs = 1. Dit impliceert, op basis van de snelheid waarmee niet-synonieme mutaties accumuleren ten opzichte van synonieme mutaties, dat δn = 0.6. Een recente analyse van intergenische regio’s in verschillende bacteriesoorten heeft geconcludeerd dat selectie in intergenische regio’s zwakker is dan op niet-synonieme plaatsen; we nemen daarom aan dat δi = 0.8 . Uit deze schattingen blijkt dat selectie ertoe leidt dat we de werkelijke mutatiesnelheid per jaar in het wild met ongeveer 27% onderschatten; dit betekent op zijn beurt dat we de DT met ongeveer 37% hebben overschat, een relatief klein effect. Om te onderzoeken hoe gevoelig deze schatting is voor de parameters in vergelijking 1, hebben we elk van deze parameters om beurten gevarieerd (elektronisch aanvullend materiaal, tabel S4). Wij vinden dat de waargenomen mutatiesnelheid het gevoeligst is voor selectie op synonieme codongebruik, want als er selectie is op synoniem codongebruik beïnvloedt dit ook onze schattingen van selectie op niet-synonieme plaatsen en in het intergenische. Als bijvoorbeeld selectie op synoniem codongebruik de synonieme accumulatiegraad met 0,5 zou drukken, zou dit leiden tot een onderschatting van de mutatiegraad met 63%, wat op zijn beurt zou leiden tot een 2,7-voudige overschatting van de DT.
Ten slotte is het mogelijk dat, hoewel in elke studie is getracht door recombinatie ontstane single nucleotide polymorfismen (SNPs) te verwijderen, er toch nog enkele in de gegevens aanwezig zijn. Gerecombineerde SNP’s kunnen twee effecten hebben. Ten eerste, als ze van buiten de clade gerecombineerd zijn, verhogen ze de schatting van de accumulatiesnelheid en leiden ze bijgevolg tot een onderschatting van de DT. Ten tweede, als er recombinatie binnen een clade optreedt, beïnvloeden ze de fylogenie en leiden ze er mogelijk toe dat de wortel van de boom jonger wordt geschat dan hij zou moeten zijn. Dit zal leiden tot een overschatting van de DT.
Het is belangrijk te beseffen dat onze methode een gemiddelde DT schat binnen een bepaalde omgeving waaruit de bacteriën zijn bemonsterd. De bacterie kan perioden van rust doormaken, afgewisseld met perioden van groei.
Ondanks de aannames die we in onze methode hebben gemaakt, komt onze schatting van de DT van Pseudomonas aruginosa van 2,3 uur in een CF-patiënt sterk overeen met die welke onafhankelijk is geschat op basis van het ribosomale gehalte van cellen, namelijk tussen 1,9 en 2,4 uur. Er zijn ook onafhankelijke aanwijzingen dat er bacteriën zijn die zich in hun natuurlijke omgeving langzaam delen. De bladluissymbiont Buchnera aphidicola verdubbelt zich in zijn gastheer naar schatting elke 175-292 uur, en Mycobacterium leprae verdubbelt zich elke 300-600 uur op muizenvoetkussentjes, niet zijn natuurlijke omgeving, maar wel een die waarschijnlijk vergelijkbaar is met de menselijke huid. Voorts hebben Avrani et al. in een recent selectie-experiment ontdekt dat verschillende E. coli-populaties, die een tekort aan hulpbronnen hadden, mutaties in het kerngen voor RNA-polymerase accumuleerden. Deze mutaties zorgden ervoor dat deze stammen zich langzamer gingen delen dan niet-gemuteerde stammen wanneer er overvloedige hulpbronnen waren. Interessant is dat dezelfde mutaties met een hoge frequentie worden aangetroffen bij niet kweekbare bacteriën, hetgeen suggereert dat er in het milieu een klasse van langzaam groeiende bacteriën bestaat die zijn aangepast aan verhongering.
Korem et al. hebben onlangs een algemene methode voorgesteld waarmee de DT kan worden geschat. Zij stellen vast dat actief replicerende bacteriële cellen twee of meer kopieën van het chromosoom hebben in de buurt van de oorsprong van de replicatie, maar slechts één kopie in de buurt van de terminus, als de celdeling snel na de voltooiing van de DNA-replicatie plaatsvindt. Met behulp van next-generation sequencing tonen zij aan dat het mogelijk is dit signaal te bepalen en dat de verhouding tussen de sequencingdiepte nabij de oorsprong en de terminus gecorreleerd is met de bacteriële groeisnelheid in vivo. Brown et al. hebben de methode uitgebreid tot bacteriën zonder referentiegenoom en/of bacteriën zonder bekende oorsprong en terminus van de replicatie. In principe zouden deze metingen van cellen die DNA repliceren kunnen worden gebruikt om de DT van bacteriën in de natuur te schatten. Het is echter onduidelijk hoe en of de methoden kunnen worden gekalibreerd. Zowel Korem et al. (2015) als Brown et al. (2016) vinden dat hun replicatiematen een mediaan van ongeveer 1,3 hebben over bacteriën in de menselijke darm. Een waarde van 1,3 vertaalt zich echter in verschillende relatieve en absolute waarden van de DT in de twee studies. Brown et al. tonen aan dat hun maat voor replicatie, iRep, sterk gecorreleerd is met de maat van Korem et al., PTR, voor gegevens van Lactobacillus gasseri; de vergelijking die de twee statistieken met elkaar in verband brengt is iRep = -0,75 + 2 PTR. Wanneer PTR = 1,3, is iRep dus 1,85 en wanneer iRep = 1,3, is PTR = 1,03. De twee methoden zijn niet consistent. Zij geven ook zeer verschillende schattingen voor de absolute DT. Korem et al. tonen aan dat PTR sterk gecorreleerd is met de groeisnelheid van E. coli gekweekt in een chemostat. Als we aannemen dat de relatie tussen PTR en groeisnelheid dezelfde is voor bacteriën in vivo en in vitro, dan impliceert dit dat de mediane DT voor het menselijke microbioom ongeveer 2,5 uur is. Brown et al. daarentegen schatten de groeisnelheid van Klebsiella oxytoca op 19,7 uur in een pasgeboren baby met behulp van fecale tellingen en vinden dat deze populatie een iRep-waarde heeft van ongeveer 1,77. Deze waarde is groter dan de overgrote meerderheid van de bacteriën in het menselijke microbioom en de bacteriën in de kandidaat-fyla-straling, hetgeen erop wijst dat de meeste bacteriën in deze twee gemeenschappen zich zeer langzaam vermenigvuldigen. Deze discrepanties tussen de twee methoden suggereren dat het wellicht niet eenvoudig is om de PTR- en iRep-methoden te kalibreren om schattingen van de DT voor alle bacteriën op te leveren.
Ten slotte, hoe moeten we onze resultaten voor de vijf focale soorten interpreteren in de context van wat er bekend is over hun ecologie? Vibrio cholerae vertoont de kortste DT van 1,1 u. Vibrio soorten zijn alomtegenwoordig in estuariene en mariene milieus. Het is bekend dat zij in kweek zeer korte generatietijden hebben; de kortste is Vibrio natriegens met slechts 9,8 min. In het wild kunnen zij een breed scala van koolstof- en energiebronnen exploiteren, en als zodanig worden zij ook wel “opportunitrofen” genoemd. Natuurlijke Vibriogemeenschappen groeien niet voortdurend in een versneld tempo, maar kunnen gedurende lange perioden in een semi-dormateuze toestand verkeren, onderbroken door snelle impulsen van hoge groeisnelheden, of bloei, wanneer de omstandigheden gunstig zijn. Er is ook beweerd dat de ongebruikelijke verdeling van Vibrio-genomen in twee chromosomen een snellere groei mogelijk maakt. Door te wijzen op een zeer korte DT bij V. cholerae, is onze analyse daarom consistent met wat bekend is over de ecologie van deze soort.
Staphylococcus aureus wordt voornamelijk aangetroffen bij dieren en mensen en bewoont verschillende lichaamsdelen, waaronder de huid en de bovenste luchtwegen . Hij kan infectie van de huid en weke delen veroorzaken, alsook bacteriëmie. Staphylococcus aureus vertoont een reeks groeimodaliteiten, waarvan sommige hem in staat kunnen stellen stress en antimicrobiële middelen in zijn gastheer te overleven. Zo kunnen kleine subpopulaties een traaggroeiende, quasi-dormante levenswijze aannemen, hetzij in een meercellige biofilm, hetzij als kleine kolonievarianten (SCV’s) of persisterende cellen. Onze korte DT van 1,8 uur suggereert dat dit niet de typische toestand is voor S. aureus in de natuur, wat niet verrassend is gezien de incidentie van SCVs in klinische monsters vrij laag is, tussen 1 en 30%.
Pseudomonas aeruginosa kan in een grote verscheidenheid van omgevingen leven, waaronder bodem, water, planten en dieren. Net als onze andere aandachtsoorten is het een opportunistische ziekteverwekker en kan het ook mensen besmetten, vooral mensen met een verzwakt immuunsysteem, zoals patiënten met CF. In deze context is de infectie chronisch. Parallelle evolutie, de differentiële regulatie van genen die P. aeruginosa in staat stellen het immuunsysteem van de gastheer te omzeilen en weerstand te bieden tegen antibiotische behandeling tijdens de infectie, en bewijzen van positieve selectie suggereren dat P. aeruginosa zich kan aanpassen aan de longen van personen met CF om op lange termijn te overleven. Het is bekend dat zij actief groeit in sputum, waar zij de beschikbare voeding gebruikt die haar groei tot hoge populatiedichtheden ondersteunt. Zijn vermogen om zich aan te passen en actief te groeien in het CF sputum is consistent met zijn relatief korte DT van 2,3 uur, vooral gezien het feit dat dit de omgeving is waarin de accumulatiesnelheid werd gemeten en die overeenkomt met de schatting van Yang et al.
Escherichia coli en S. enterica verblijven voornamelijk in de lagere darm van mensen en dieren, maar kunnen ook in het milieu overleven. Hoewel E. coli vaak uit milieumonsters wordt gerecupereerd, wordt niet aangenomen dat zij in staat is te groeien of gedurende langere perioden te overleven buiten de ingewanden van warmbloedige dieren, behalve in tropische gebieden waar de omstandigheden gunstiger zijn, hoewel sommige fylogenetisch verschillende stammen zich blijken te reproduceren en goed in het milieu blijken te overleven. Salmonella daarentegen is ook een darmkolonisator van koudbloedige dieren, in het bijzonder reptielen, en is beter aangepast dan E. coli om in omgevingsniches te overleven en te groeien. Salmonella kan bijvoorbeeld ten minste een jaar in de bodem overleven en groeien, terwijl E. coli slechts een paar dagen kan overleven. Hoewel deze secundaire niches bij Salmonella een grotere rol kunnen spelen dan bij E. coli, blijft het zo dat de groeisnelheden in het milieu veel lager zullen zijn dan die in een darm. Daarom zou de grotere hardnekkigheid van Salmonella in niet-gastheer-omgevingen in vergelijking met E. coli de tragere DT bij deze soort kunnen helpen verklaren.
Samenvattend kunnen we uit de beschikbaarheid van accumulatie- en mutatiesnelheidsschattingen de DT voor bacteriën in het wild afleiden, alsmede de verdeling van wilde DT’s over bacteriesoorten. Deze schattingen van de DT zijn waarschijnlijk onderschattingen omdat de mutatiesnelheid per generatie in het wild naar verwachting hoger is dan in het laboratorium, en sommige mutaties niet door DNA-replicatie worden gegenereerd. Onze analyse suggereert dan ook dat DT’s in de natuur doorgaans langer zijn dan in het laboratorium, dat ze aanzienlijk verschillen tussen bacteriesoorten en dat een aanzienlijk deel van de soorten in de natuur zeer lange DT’s heeft.