Primer (moleculaire biologie)
Synthetische primers zijn chemisch gesynthetiseerde oligonucleotiden, meestal van DNA, die kunnen worden aangepast om te annealiseren op een specifieke plaats op het template-DNA. In oplossing hybridiseert de primer spontaan met de template via Watson-Crick baseparing alvorens door DNA polymerase te worden verlengd. De mogelijkheid om synthetische primers te maken en aan te passen is een instrument van onschatbare waarde gebleken voor een verscheidenheid van moleculair biologische benaderingen waarbij DNA wordt geanalyseerd. Zowel voor de Sanger-kettingbeëindigingsmethode als voor de “Next-Gen”-methode van DNA-sequencing zijn primers nodig om de reactie op gang te brengen.
PCR primer designEdit
De polymerase-kettingreactie (PCR) maakt gebruik van een paar aangepaste primers om de DNA-verlenging naar elkaar toe te leiden aan tegenovergestelde uiteinden van de sequentie die wordt geamplificeerd. Deze primers zijn doorgaans tussen 18 en 24 basen lang, en mogen alleen coderen voor de specifieke upstream- en downstream-plaatsen van de te amplificeren sequentie. Een primer die zich aan meerdere regio’s van het DNA kan binden, zal ze allemaal amplificeren, waardoor het doel van PCR teniet wordt gedaan.
Bij het ontwerpen van een paar PCR-primers moeten enkele criteria in acht worden genomen. Paren primers moeten vergelijkbare smelttemperaturen hebben, aangezien de annealing tijdens PCR voor beide strengen tegelijk plaatsvindt, en deze gedeelde smelttemperatuur mag niet te veel hoger of lager zijn dan de annealingtemperatuur van de reactie. Een primer met een Tm (smelttemperatuur) die te veel hoger is dan de annealingtemperatuur van de reactie kan mishybridiseren en zich op een onjuiste plaats in de DNA-sequentie uitbreiden. Een Tm die aanmerkelijk lager is dan de annealingtemperatuur kan helemaal niet annealiseren en zich uitstrekken.
Extra moeten primerreeksen zo worden gekozen dat ze een unieke selectie voor een DNA-gebied opleveren, zodat hybridisatie met een soortgelijke reeks in de buurt wordt voorkomen. Een veelgebruikte methode voor de selectie van een primer-site is BLAST-zoeken, waarbij alle mogelijke regio’s waaraan een primer kan binden, kunnen worden bekeken. Zowel de nucleotidenvolgorde als de primer zelf kunnen met BLAST worden doorzocht. Het gratis NCBI-hulpprogramma Primer-BLAST integreert primerontwerp en BLAST-zoeken in één toepassing, evenals commerciële softwareproducten zoals ePrime en Beacon Designer. Computersimulaties van theoretische PCR-resultaten (Electronic PCR) kunnen worden uitgevoerd om te helpen bij het ontwerpen van primers door het geven van smelt- en annealingtemperaturen, enz.
Veel online-hulpmiddelen zijn gratis beschikbaar voor het ontwerpen van primers, waarvan sommige zich richten op specifieke toepassingen van PCR. De populaire programma’s Primer3Plus en PrimerQuest kunnen worden gebruikt om primers te vinden die aan een groot aantal specificaties voldoen. Zeer ontaarde primers voor een grote verscheidenheid van DNA-sjablonen kunnen interactief worden ontworpen met GeneFISHER. Primers met een hoge specificiteit voor een subset van DNA-sjablonen in aanwezigheid van veel vergelijkbare varianten kunnen worden ontworpen met DECIPHER. Bij het ontwerpen van primers wordt gestreefd naar een evenwicht tussen specificiteit en amplificatie-efficiëntie.
Het selecteren van een specifieke DNA-regio voor primerbinding vereist een aantal aanvullende overwegingen. Regio’s met veel mononucleotide- en dinucleotideherhalingen moeten worden vermeden, omdat lusvorming kan optreden die tot mishybridisatie kan leiden. Primers mogen niet gemakkelijk annealiseren met andere primers in het mengsel; dit verschijnsel kan leiden tot de productie van “primer dimer”-producten die de eindoplossing verontreinigen. Primers mogen ook niet sterk aan zichzelf annealiseren, aangezien interne haarspelden en lussen de annealing met het template-DNA kunnen belemmeren.
Bij het ontwerpen van primers kunnen extra nucleotidebasen worden toegevoegd aan de achtereinden van elke primer, wat resulteert in een aangepaste cap-sequentie aan elk uiteinde van het geamplificeerde gebied. Een toepassing van deze praktijk is voor gebruik bij TA-klonering, een speciale subkloneringstechniek die lijkt op PCR, waarbij de efficiëntie kan worden verhoogd door AG-staarten aan de 5′- en de 3′-uiteinden toe te voegen.
Gedegenereerde primersEdit
Sommige situaties kunnen vragen om het gebruik van degenerate primers. Dit zijn mengsels van primers die op elkaar lijken, maar niet identiek zijn. Dit kan handig zijn bij het amplificeren van hetzelfde gen uit verschillende organismen, omdat de sequenties waarschijnlijk gelijk, maar niet identiek zijn. Deze techniek is nuttig omdat de genetische code zelf ontaard is, wat betekent dat verschillende codons kunnen coderen voor hetzelfde aminozuur. Hierdoor kunnen verschillende organismen een aanzienlijk verschillende genetische sequentie hebben die codeert voor een sterk gelijkend eiwit. Om deze reden worden degenerate primers ook gebruikt wanneer het primerontwerp gebaseerd is op eiwitsequentie, aangezien de specifieke volgorde van de codons niet bekend is. Daarom zou een primersequentie die overeenkomt met het aminozuur isoleucine “ATH” kunnen zijn, waarbij A staat voor adenine, T voor thymine, en H voor adenine, thymine, of cytosine, volgens de genetische code voor elk codon, met gebruikmaking van de IUPAC-symbolen voor ontaarde basen. Degenerate primers hybridiseren mogelijk niet perfect met een doelsequentie, waardoor de specificiteit van de PCR amplificatie sterk kan afnemen.
Degenerate primers worden veel gebruikt en zijn uiterst nuttig op het gebied van de microbiële ecologie. Zij maken de amplificatie mogelijk van genen van tot dusverre ongecultiveerde micro-organismen of maken het mogelijk genen te recupereren van organismen waarvan de genomische informatie niet beschikbaar is. Gewoonlijk worden degenerate primers ontworpen door sequenties van genen in GenBank op elkaar af te stemmen. Met verschillen tussen de sequenties wordt rekening gehouden door gebruik te maken van de IUPAC-degeneraties voor de afzonderlijke basen. PCR-primers worden dan gesynthetiseerd als een mengsel van primers die corresponderen met alle permutaties van de codon-sequentie.