Type renale substitutietherapie (hemodialyse versus peritoneale dialyse) heeft geen invloed op de cytokine genexpressie of klinische parameters van kandidaten voor een niertransplantatie

Abstract

Patiënten met nierinsufficiëntie lijden aan immuunstoornissen, veroorzaakt door uremische toxines en beïnvloed door de dialysebehandeling. Het doel van deze studie was te onderzoeken of het type dialysemodaliteit (hemodialyse, HD, versus peritoneale dialyse, PD) een differentiële invloed heeft op de immunocompetentie, in het bijzonder op de expressie van genen betrokken bij de immuunrespons. Materiaal. 87 niertransplantatiekandidaten (66 HD, 21 PD) werden geïncludeerd in de studie. Methoden. De perifeer bloed RNA monsters werden verkregen met het PAXgene Blood systeem vlak voor de transplantatie. De genexpressie van CASP3, FAS, TP53, FOXP3, IFNG, IL2, IL6, IL8, IL10, IL17, IL18, LCN2, TGFB1, en TNF werd beoordeeld met real-time PCR op op maat ontworpen arrays met lage dichtheid (TaqMan). Genexpressiegegevens werden geanalyseerd in relatie tot pretransplantatie klinische parameters. Resultaten. De gemiddelde expressie van de onderzochte genen vertoonde geen significante verschillen tussen PD en HD, met uitzondering van FAS, waarvan de expressie 30% hoger was in PD patiënten vergeleken met de HD groep. Er was een niet-significant hogere expressie van proinflammatoire cytokines in de PD groep. De klinische ontstekingsparameters (CRP, albumine, cholesterol, en hemoglobine niveaus) verschilden niet tussen de groepen. Conclusie. Het type nierfunctievervangende therapie heeft geen verschillend effect op cytokine genexpressie of inflammatoire klinische parameters.

1. Inleiding

Eindstadium nierziekte (ESRD) staat bekend als een toestand van immuun incompetentie, die resulteert in verschillende immuunafwijkingen. Systemische en lokale micro-inflammatie gepaard gaande met immuundeficiëntie wordt waargenomen bij patiënten met uremie. Inadequate reactie op vaccinatie, bijvoorbeeld tegen hepatitis B, is beschreven bij patiënten met ESRD . Deze patiënten zijn ook vatbaarder voor zowel virale als bacteriële infecties, die de tweede (na cardiovasculaire) belangrijkste oorzaak van sterfte zijn tijdens niervervangingstherapie . De invloed van ondervoeding en inflammatoire cytokines op cardiovasculaire risico’s, infecties en sterftecijfers is uitgebreid onderzocht. Van uremie en secundaire hyperparathyroïdie is sinds de jaren negentig bekend dat ze de functie van B- en T-lymfocyten en de productie van antilichamen beïnvloeden.

Nieuw werd gemeld dat uremie de cytokinesynthese beïnvloedt. Gedeeltelijk kan dit fenomeen worden verklaard door het tekort aan neutrofielen, alsook door veranderingen in de neutrofielenfunctie bij ESRD . De chronische ontsteking kan worden vastgesteld aan de hand van verhoogde bloedspiegels van C-reactief proteïne (CRP) en sommige cytokinen, bijvoorbeeld IL-6, IL-18, IL-10, en TNF-alfa . Ook een abnormale functie van regulatoire T-cellen bij uremie en een onevenwicht tussen onrijpe en geheugen B-cellen zijn gerapporteerd

De hierboven beschreven afwijkingen worden nog versterkt door niervervangingstherapie. Activering van de Th2-route met een mogelijk tolerogeen effect werd waargenomen tijdens hemodialyse. Bovendien had peritoneale dialyse (vooral met lactaat-gebufferde peritoneale vloeistoffen) een nadelig effect op de Th1 cel subsets en bevorderde het Th2 type van immuunrespons . In tegenstelling hiermee rapporteerden sommige auteurs geen invloed van niervervangende therapie op cytokine en serum CRP niveaus.

Hoewel immuundefecten goed beschreven zijn in de literatuur, is het nog steeds niet duidelijk of het type dialysemodaliteit (hemodialyse versus peritoneale dialyse) differentieel de immunocompetentie beïnvloedt, met name de expressie van genen betrokken bij de immuunrespons en ontsteking met de verandering in inflammatoire genprofielen bij patiënten op de actieve wachtlijst voor transplantatie. Het doel van deze studie was om pretransplantatie bloed cytokine en apoptose gerelateerde genexpressie te onderzoeken om mogelijke verschillen in patiënten op hemodialyse (HD) en peritoneale dialyse (PD) in relatie tot klinische indices van ondervoeding en ontstekingsprocessen te onthullen.

We richtten ons op de immuunfactoren waarvan bekend is dat ze verband houden met weefselbeschadiging en ontsteking (IL-6, IL-8, IL-17, IL-18, NGAL, en TNF-alfa), apoptose (Fas, caspase-3, en p53) en Th1-lymfocytenactivering (IFN-gamma, IL-2), evenals Th2 (IL-10, TGF-beta1), en regulatoire T-celfunctie (FoxP3).

2. Materiaal

De studie werd uitgevoerd bij 87 niertransplantatiekandidaten (leeftijd 16-72 jaar, gemiddeld 47 jaar; 34 vrouwen, 53 mannen) die in het ziekenhuis waren opgenomen voor transplantatiechirurgie. Van hen werden 66 patiënten behandeld met hemodialyse en 21 patiënten met peritoneale dialyse. De kenmerken van de patiënten zijn weergegeven in tabel 1.

Alle HD-patiënten werden behandeld door hemodialyse met lage flux op polysulfonmembraandialyses met bicarbonaat bevattende oplossingen gedurende 4 uur, driemaal per week.

Alle patiënten uit de PD-groep werden continu ambulant peritoneaal gedialyseerd. De standaardoplossingen van 2 l volume met verschillende concentraties glucose (meestal 3 keer met 1,36/1,5%, en één keer met 2,3%) werden gebruikt. Er werden geen icodextrine- of aminozuurbevattende oplossingen gebruikt.

Weekelijkse Kt/V > 1,7 werd bij alle PD-patiënten gerapporteerd. In de HD-groep was de Kt/V per sessie bij alle proefpersonen >1,2. De patiënten bleven op niervervangingstherapie van 1 tot 97 maanden (gemiddeld 25 ± 18 maanden).

Bloedmonsters voor routinematige laboratoriumtesten evenals genexpressie werden genomen tijdens onmiddellijk pretransplantatie onderzoek vóór het introduceren van immunosuppressieve therapie. De monsters werden verkregen ten minste 6 uur na de laatste HD-sessie of ten minste 4 uur na de laatste peritoneale vloeistofverwijdering.

Klinische gegevens werden verkregen uit medische dossiers van de dialysecentra van de patiënten.

Het project werd uitgevoerd na goedkeuring van de Commissie voor Bio-ethiek van de Medische Universiteit van Wroclaw, en alle aspecten van het onderzoek waren in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki van de World Medical Association. Elke patiënt las een informatieblad en gaf volledig geïnformeerde toestemming.

3. Methoden

De perifere bloedmonsters werden verkregen met PAXgene Bloed RNA buisjes. RNA werd geïsoleerd met een PAXgene Blood RNA kit (PreAnalytics) en getranscribeerd met een High Capacity RNA to cDNA kit (Applied Biosystems). De perifere bloed genexpressie van caspase-3 (CASP3, Hs00263337_m1), FAS (FAS, Hs00236330_m1), p53 (TP53, Hs00153349_m1), FOXP3 (FOXP3, Hs00203958_m1), IFN-gamma (IFNG, Hs00174143_m1), interleukine-2 (IL2, Hs00174114_m1), interleukine-6 (IL6, Hs00174131_m1), interleukine-8 (IL8, Hs00174103_m1), interleukine-10 (IL10, Hs00174086_m1), interleukine-17 (IL17A, Hs99999082_m1), interleukine-18 (IL18, Hs00155517_m1), NGAL (LCN2, Hs00194353_m1), TGF-beta (TGFB1, Hs999918_m1), en TNF-alfa (TNF, Hs00174128_m1) werd beoordeeld met real-time PCR op speciaal ontworpen arrays met lage dichtheid (TaqMan) met TaqMan PCR Master Mix. Alle procedures werden uitgevoerd volgens de protocollen van de fabrikant. GAPDH (Hs99999905_m1) werd als referentiegen gekozen en bleek invariant te zijn tussen de bestudeerde groepen.

De expressiegegevens worden gepresenteerd als ΔΔCt = ΔCtHD – ΔCtsample, waarbij ΔCtHD de gemiddelde waarde is van ΔCtsample voor de HD-groep, ΔCtsample = Ctgene – CtGAPDH, en Ct de cyclusdrempelwaarde is en het berekende aantal cycli definieert, waarin de tijdens de PCR-reactie gemeten fluorescentie toeneemt tot boven de vooraf ingestelde drempelwaarde. Bovenstaande vergelijking levert expressiegegevens op met betrekking tot zowel het GAPDH-referentiegen als het gemiddelde expressieniveau voor HD, dat hier als referentiegroep wordt beschouwd. De relatieve verandering in de waargenomen expressie van PD versus HD wordt berekend als voor de gemiddelde ΔΔCt voor PD.

3.1. Statistische analyse

Statistische analyse werd uitgevoerd met het statistische pakket Statistica v.10 (StatSoft, Polen). De chi-kwadraat toets werd gebruikt om het verschil in proporties tussen twee groepen te evalueren. De aanname van normaliteit werd getest voor elke continue variabele. Het verschil tussen de twee groepen werd geëvalueerd met een -test of, in het geval van gebrek aan normaliteit, werd het geanalyseerd met de Mann-Whitney -test. De correlaties werden getest met respectievelijk Pearson correlatie of Spearman correlatie. werd als significant beschouwd.

4. Resultaten

4.1. Klinische parameters

De groepen patiënten verschilden niet significant naar leeftijd, geslacht, of BMI verdeling. De tijd van niervervangingstherapie was significant korter in de PD-groep vergeleken met de HD-groep (mediaan : 15 versus 24,5 maanden, resp.).

De klinische pretransplantatie bloedparameters worden gepresenteerd in Tabel 2. De klinische ontstekingsparameters (CRP, albumine, cholesterol, en hemoglobine niveaus) en serum creatinine evenals ijzergehalte met transferrine saturatie en iPTH verschilden niet tussen de groepen. Alleen de pretransplantatie serum urinezuur concentratie was significant hoger in de PD groep (mediaan : 4.9 versus 6.5 mg/dL). De leeftijd van de patiënt en het CRP-niveau waren lager in de PD-groep, maar de verschillen bereikten geen statistische significantie.

4.2. Genexpressie

De gemiddelde expressieniveaus van de genen worden gepresenteerd in Tabel 3. IL17 genexpressie was niet aantoonbaar bij alle patiënten.

De gemiddelde serumexpressie van de genen vertoonde geen significante verschillen tussen PD en HD, met uitzondering van FAS, waarvan de expressie 1,29 maal hoger was (95% CI 1,03-1.61) bij PD-patiënten in vergelijking met de HD-groep (figuur 1).

Figuur 1

ΔCt die de relatieve genexpressie beschrijft van FAS versus GAPDH in peritoneale dialyse (PD) en hemodialyse (HD) groep, gerelateerd aan het gemiddelde voor HD monsters. Grafiek weergegeven als vierkant: gemiddelde, box: gemiddelde ± SE, en whiskers: 95% CI.

Hoewel hogere genexpressie van proinflammatoire cytokines (IFNG, IL6, en IL18) in de PD-groep werd waargenomen, waren de verschillen niet statistisch significant. Ook de lagere genexpressie van IL10 en de hogere genexpressie van TGFB1 die in de PD-groep werden waargenomen, waren niet statistisch significant.

We vonden een significant lagere (0,68x, 95% CI 0,50-0,93) relatieve expressie van IL10 tot FAS in de PD-groep vergeleken met de HD-groep (-test, ). Wij vonden ook een lagere (0,74x, 95% CI 0,55-1,01) relatieve expressie van IL10 ten opzichte van IL18 van borderline significantie (-test, ). Lagere (0,60x, 95% CI 0,35-1,04) relatieve expressie van IL10 ten opzichte van IFNG in de PD groep vergeleken met de HD groep bereikte geen statistische significantie (-test, ).

De expressie van sommige genen was gerelateerd aan klinische parameters van de patiënten. De correlaties worden gepresenteerd in tabel 4. Het tijdstip van de niervervangingstherapie had geen invloed op de expressie van een van de onderzochte genen.

FOXP3-expressie was negatief gecorreleerd met WBC in beide groepen (, , en ), vergezeld van IL2 en IL6 (, , en , , resp.). IL10 genexpressie correleerde significant met albuminegehalte (, ). LCN2 (NGAL) genexpressie was positief gecorreleerd met WBC (, ). Ook BMI was positief gecorreleerd met LCN2 genexpressie (, ) (figuur 2).

Figuur 2

ΔCt die de relatieve genexpressie van LCN2 (NGAL) versus BMI beschrijft.

5. Discussie

Eindstadium nierziekte (ESRD) wordt geassocieerd met zowel ontsteking als immuundeficiëntie . In onze studie hebben we ons gericht op de brede waaier van immuunfactoren waarvan bekend is dat ze verband houden met ontsteking, apoptose, en lymfocyt Th1 en Th2 activatie, evenals regulatoire T-cel functie. Het moet benadrukt worden dat de studie relatief gezonde HD en PD patiënten omvatte net voor de transplantatie. Het algemene welzijn van de patiënten maakte het mogelijk dat zij in aanmerking kwamen voor niertransplantatie en verschilden niet wat betreft klinische indicatoren, met uitzondering van de kortere dialysebehandelingsperiode in de PD-groep. In deze geselecteerde groep waren de belangrijkste bevindingen van onze studie als volgt: klinische symptomen van chronische ontsteking in het algemeen onderscheidden de PD-groep niet van de HD-groep. Ook de pro- en anti-inflammatoire genexpressie was vergelijkbaar in beide onderzochte groepen. Een uniform type Th1 en Th2 activeringspatroon werd in beide groepen gezien.

Alleen een verhoogde apoptosegraad met verhoogde FAS genexpressie werd gezien in PD patiënten vergeleken met HD patiënten. Verlaagde relatieve expressie van IL10 ten opzichte van pro-inflammatoire cytokines (IL18, IL10, IL6, en IFNG) in de PD groep vergeleken met de HD groep werd ook waargenomen. De tijd van niervervangingstherapie was de enige klinische parameter die de HD-groep van de PD-groep onderscheidde. Desondanks had het tijdstip van de nierfunctievervangende therapie geen invloed op de expressie van de onderzochte genen. Daarom lijkt de waargenomen upregulatie van het FAS gen uitsluitend toe te schrijven aan het type dialyse.

Neutrofiele deficiëntie en disfunctie als gevolg van niet alleen uremische toxinen maar ook ondervoeding-inflammatie-atherosclerose (MIA) syndroom en dialyse werd gerapporteerd . Chronische ontsteking met versnelling van atheromatose is verantwoordelijk voor de hoge morbiditeit en mortaliteit bij dialysepatiënten. T-helper lymfocyten waren gepolariseerd naar het Th2 fenotype met hogere synthese van IL-4 en IL-10 bij uremische patiënten en lagere afgifte van IFN-gamma . Deze rapporten suggereren dat uremie geassocieerd is met een overwicht van Th2 cellen en een omschakeling van cytokine synthese naar een gedeprimeerde cel-gemedieerde immuniteit. In onze studie observeerden wij het universele patroon van immuunactivatie bij patiënten op de actieve wachtlijst zonder omschakeling naar een Th1 of Th2 respons.

Overgeactiveerde maar functioneel gecompromitteerde Tregs werden beschreven in ESRD. De basale IL2 en FOXP3 mRNA niveaus waren hoog maar stegen niet bij stimulatie. In de ESRD-groep werd een onevenwichtigheid van de Treg/Th17-functie beschreven in vergelijking met de gezonde controles. In onze studie was de IL17 genexpressie bij alle patiënten niet aantoonbaar, zodat het van verdere analyse werd uitgesloten.

De laboratoriumindices van micro-inflammatie omvatten verhoogde bloedspiegels van CRP en sommige cytokines, voornamelijk IL-6, IL-18, IL-10, en TNF-alfa, die correleerden met versnelling van atherosclerose . Hypoalbuminemie was een risicofactor voor septicemie bij dialysepatiënten. Ondervoeding kan worden veroorzaakt door chronische ontsteking via verhoogde niveaus van pro-inflammatoire cytokines . Geen openlijke ondervoeding werd waargenomen bij onze studie patiënten. Het studiecohort bestond uit patiënten op de actieve wachtlijst, dus een geselecteerde groep van patiënten op RRT, gezonder dan de gemiddelde dialysepopulatie. Ook de gedetecteerde albumine niveaus waren binnen normale grenzen voor de meerderheid van de patiënten. Wij stelden vast dat het albumine niveau significant correleerde met IL10 genexpressie bij alle patiënten en in de HD groep. Dit is een verwachte bevinding omdat hypoalbuminemie werd beschreven als een krachtige factor die chronische ontsteking versterkt. Anti-inflammatoire mechanismen van IL-10 werden gerapporteerd om de productie van een breed gamma van pro-inflammatoire factoren te beperken. In onze studie hebben wij ook waargenomen dat de relatieve anti-inflammatoire IL10 genexpressie ten opzichte van de pro-inflammatoire genen IL6, IFNG, en IL18 lager was in de PD groep vergeleken met de HD groep. Dit feit kan wijzen op het geïntensiveerde ontstekingsproces in de PD-groep.

Chronische activatie van het immuunsysteem kan verder worden geïntensiveerd door niervervangingstherapie. Verschillende studies werden uitgevoerd om te onderzoeken of het type dialysetechniek de inductie van een chronische ontstekingsstaat kan beïnvloeden.

Het gebruik van verschillende peritoneale vloeistoffen werd geassocieerd met een verstoord Th1/Th2 evenwicht. Het gebruik van lactaat-gebufferde peritoneale vloeistof heeft een nadelig effect op de Th1 cel in vergelijking met zowel icodextrine-oplossing als lactaat/bicarbonaat-gebufferde oplossing. Integendeel, er werd geen invloed van de biocompatibiliteit van PD-oplossingen op enige parameter van het MIA-syndroom gerapporteerd. Hwang et al. rapporteerden dat IL6 genpolymorfisme de peritoneale solutentransportsnelheid beïnvloedde bij PD patiënten.

Er zijn tegenstrijdige rapporten gepubliceerd over geen invloed van niervervangingstherapie op cytokine en serum CRP niveaus. In onze studie was het CRP-niveau alleen in de PD-groep negatief gecorreleerd met TNF-genexpressie. De belangrijkste cellulaire oorsprong van TNF-alfa zijn geactiveerde macrofagen. De eerdere rapporten over het verband tussen CRP-niveaus en TNF-alfa expressie waren inconsistent, wat erop wijst dat de aanwezigheid van TNF-alfa in bloed afhangt van een complexe relatie in de ontstekingsreactie en mogelijk niet de biologische activiteit op weefselniveau weerspiegelt. In onze studie werden bijna alle patiënten uit de HD-groep meer dan 6 uur na de hemodialyse onderzocht, zodat geen rekening werd gehouden met het effect van de enkele hemodialyse-sessie op de genexpressie.

Increased apoptosis of leukocytes associated with increased serum Fas and p53 protein levels as well as decreased antiapoptotic bcl-2 gene expression from neutrophils has been described in ESRD patients . In onze studie vonden we dat bij PD patiënten de expressie van proapoptotisch FAS significant hoger was dan bij HD patiënten. Bovendien was de expressie van proapoptotisch TP53 negatief gecorreleerd met WBC. De klinische betekenis van deze waarneming blijft onduidelijk, behalve een speculatie over een meer evenwichtige immuun- en ontstekingsceltoestand in de PD transplantatiekandidaten. Ook ondersteunt deze observatie de hypothese dat verhoogde apoptose van neutrofielen het totale WBC in uremische patiënten beïnvloedt.

Ook vonden we dat NGAL genexpressie (LCN2) positief gecorreleerd was met WBC in alle patiënten en de HD groep. NGAL is een eiwit dat vooral door neutrofielen, maar ook door niertubulaire cellen en sommige extrarenale cellen, vooral adipocyten, wordt afgegeven en sterk afhankelijk is van hun absolute aantal, zodat de positieve correlatie met WBC niet verrassend is en andere rapporten bevestigt. Bovendien vonden we een sterke correlatie van NGAL genexpressie met BMI, wat overeenkomt met andere rapporten van auteurs en de observatie ondersteunt dat NGAL nauw samenhangt met obesitas.

6. Beperkingen van de studie

Hoewel dit naar ons weten het eerste gepubliceerde rapport is dat cytokine- en apoptose-gerelateerde genexpressie direct vergelijkt tussen HD- en PD-patiënten in de pretransplantatieperiode, moeten enkele potentiële beperkingen worden vermeld.

Wij analyseerden gegevens van meer patiënten die werden behandeld met HD dan met PD. Het verschil tussen het aantal patiënten dat met deze twee dialysemodaliteiten wordt behandeld, weerspiegelt de algemene situatie op het gebied van niervervangingstherapie. Minder dan 5% van de patiënten met nieraandoeningen in het eindstadium wordt behandeld met PD in Polen, wat vergelijkbaar is met de situatie in de wereld, waar minder dan 11% van de patiënten wordt behandeld met PD.

Deze studie was gebaseerd op een eenmalige beoordeling van inflammatoire cytokine-expressie en klinische coëfficiënten op één tijdstip. We hadden geen mogelijkheid om tijdsafhankelijke veranderingen in cytokine genexpressies te beoordelen. Het concept werd gekozen op basis van het feit dat patiënten die in aanmerking komen voor transplantatie momenteel niet lijden aan een acute infectie. Gewoonlijk hebben zij een zeer goede klinische status met een hoge dialyse-efficiëntie. Alle patiënten waren op het ogenblik van de transplantatie klinisch stabiel, zonder tekenen van ontsteking, zonder kanker, ontstekingsziekten of immunosuppressieve therapie te hebben gehad. Onze resultaten werden verkregen voor een relatief homogene groep potentiële ontvangers op een actieve wachtlijst, die niet representatief is voor alle patiënten met een niervervangingstherapie.

7. Conclusie

Type niervervangingstherapie heeft geen differentieel effect op cytokine genexpressie of inflammatoire klinische parameters, met uitzondering van een verhoogd apoptosepercentage met verhoogde FAS genexpressie bij PD-patiënten in vergelijking met HD-patiënten. Ook de gerelateerde anti-inflammatoire IL10 genexpressie ten opzichte van pro-inflammatoire cytokines was verlaagd in de PD groep. Mogelijk is uremie de krachtigste factor die immuunactivatie teweegbrengt, en zijn verdere veranderingen geïnduceerd door de verschillende types van niervervangingstherapie te subtiel om duidelijk te zijn. De intensiteit van de ontstekingsreactie, gemeten aan de hand van cytokine genexpressie, kan de posttransplantatie alloimmuunrespons en de overleving van het transplantaat verder beïnvloeden.

Afkortingen

Belangenverstrengeling

De auteurs verklaren dat er geen belangenverstrengeling is met betrekking tot de publicatie van dit artikel.

Erkenning

Deze studie werd ondersteund door een onderzoekssubsidie van de Poolse Vereniging voor Nefrologie, gefinancierd door Baxter.