BCR/ABL: from molecular mechanisms of leukemia induction to treatment of chronic myelogenous leukemia

Inhibitory białka fuzyjnego BCR/ABL

Ponieważ wiadomo, że rozregulowana aktywność kinazy tyrozynowej p210BCR/ABL jest istotnym zdarzeniem transformującym w CML, rozpoczęto badania mające na celu zahamowanie tej aktywności TK (Lugo i wsp., 1990; Oda i wsp., 1995).

Kilka inhibitorów kinaz tyrozynowych zostało ocenionych w komórkach CML (Boutin, 1994; Levitzki i Gazit, 1995). Jako pierwsze testowane były związki izolowane ze źródeł naturalnych, takie jak antybiotyki herbimycyna-A, genisteina i erbstatyna, które hamują aktywność p210BCR/ABL TK in vitro, hamują wzrost linii komórkowych BCR/ABL+ in vitro oraz indukują różnicowanie erytroidalne linii komórkowej K562 (Carlo-Stella i wsp., 1996; Honma i wsp., 1989, 1990; Kawada i wsp., 1993; Okabe i wsp., 1992). Następnie opracowano związki syntetyczne, tyrfostyny, i zidentyfikowano AG957 i AG568, które hamują aktywność p210BCR/ABL TK in vitro oraz indukują różnicowanie erytroidów i apoptozę linii komórkowej K562 (Anafi i in., 1993). Ponadto, AG957 przywraca adhezję pierwotnych komórek CML w oparciu o β1-integrynę (Bhatia et al., 1998). AG957 ma również synergistyczny efekt antyproliferacyjny z receptorem antyfas na progenitorach CML (Carlo-Stella i wsp., 1999). Jednak głównym ograniczeniem tych inhibitorów TK jest niska swoistość dla aktywności BCR/ABL TK.

STI571

Pod koniec lat 80. zidentyfikowano 2-fenyloaminopirymidynę o specyficznej aktywności hamującej kinazy tyrozynowe wobec receptora płytkopochodnego czynnika wzrostu (PDGF-R), C-kit i kinazy tyrozynowej ABL, STI571 (dawniej CGP57148, obecnie Gleevec lub mesylan imatynibu) (Buchdunger i in., 1996; Druker i Lydon, 2000). Podobnie jak tyrfostyny, STI571 działa poprzez wiązanie się z wysoce konserwowaną kieszenią wiążącą nukleotydy w katalitycznej domenie ABL-TK i kompetycyjnie blokuje wiązanie ATP (Schindler i in., 2000).

Badania przedkliniczne wykazały, że STI571 specyficznie hamuje proliferację komórek białaczkowych i przywraca zależny od interleukiny-3 (IL-3) wzrost i różnicowanie linii komórkowych BCR/ABL+. Wzrost szpikowych komórek tworzących kolonie CML jest silnie hamowany przez STI571, przy minimalnym wpływie na wzrost normalnych kolonii (Carroll et al., 1997; Deininger et al., 1997; Druker et al., 1996; Gambacorti-Passerini et al., 1997). Wynika to z zahamowania proliferacji i w mniejszym stopniu śmierci komórek (Holtz i in., 2002). Długotrwała hodowla komórek BM z przedłużoną ekspozycją na STI571 wykazała działanie hamujące na progenitory CML przy niewielkiej toksyczności dla komórek prawidłowych (Kasper i in., 1999). Jednakże, do 30-40% Ph+ LTC-IC przeżywa leczenie STI571 (Holtz i wsp., 2002). Ponadto, hamowanie aktywności kinazy BCR/ABL przez STI571 powoduje modyfikację transkrypcyjną różnych genów zaangażowanych w kontrolę cyklu komórkowego, adhezji komórkowej i organizacji cytoszkieletu (Deininger i in., 2000), prowadząc do apoptotycznej śmierci przynajmniej niektórych komórek Ph+. Badania na myszach wykazały efekt in vivo STI571 przeciwko komórkom BCR/ABL+. Jednakże, ciągła ekspozycja na STI571 była konieczna do zlikwidowania guzów generowanych przez 32DBCR/ABL (le Coutre et al., 1999). Przed badaniami klinicznymi wykazano, że STI571 ma akceptowalny profil toksyczności u zwierząt (Druker i Lydon, 2000).

W czerwcu 1998 roku rozpoczęto badanie kliniczne fazy I z zastosowaniem STI571 (Druker i in., 2001b). Badanie to było badaniem eskalacji dawki, zaprojektowanym w celu ustalenia maksymalnej tolerowanej dawki u 54 pacjentów w przewlekłej fazie CML, u których zawiodła terapia IFN-α. Wyniki podsumowano w Tabeli 1. Działania niepożądane były minimalne, bez toksyczności ograniczającej dawkę.

Badania I fazy rozszerzono na pacjentów z CML w kryzysie blastycznym mieloidalnym i limfoidalnym oraz pacjentów z nawrotową lub oporną na leczenie Ph-dodatnią ALL. Pacjenci byli leczeni dawkami dobowymi 300-1000 mg STI571. Wyniki podsumowano w Tabeli 2. STI571 wykazuje znaczną aktywność pojedynczego leku w kryzy blastycznej CML i Ph-dodatniej ALL, ale odpowiedzi nie są trwałe (Druker i wsp., 2001a).

Po badaniu I fazy przeprowadzono duże międzynarodowe badanie II fazy w okresie od grudnia 1999r. do maja 2000r, w celu oceny bezpieczeństwa i skuteczności STI571 u pacjentów z CML opornych na interferon i nietolerujących interferonu, Ph-dodatnich, jak również u pacjentów z CML w fazie przyspieszonej, CML w kryzy blastycznej i Ph-dodatnich pacjentów z ALL (Kantarjian et al., 2002; Sawyers i wsp., 2000; Talpaz i wsp., 2002). Do tego badania włączono ponad 1000 pacjentów w 27 ośrodkach w sześciu krajach w okresie 6-9 miesięcy. Wyniki podsumowano w tabeli 3. Badanie to potwierdziło wyniki zaobserwowane w fazie I i stanowiło podstawę do przyspieszonego zatwierdzenia STI572 przez Food and Drug Administration (FDA).

Od tego czasu, badanie III fazy z randomizacją porównujące STI571 z interferonem i cytarabiną u nowo zdiagnozowanych pacjentów zgromadziło ponad 1000 pacjentów w okresie sześciu miesięcy, a zbieranie danych jest w toku.

Klinicznie, u większości pacjentów, u których dochodzi do nawrotu choroby po wstępnej odpowiedzi na STI571, dochodzi do reaktywacji kinazy BCR/ABL (Gorre i in., 2001). Badania in vitro na mysich i ludzkich BCR/ABL-dodatnich liniach komórkowych opornych na STI571 wykazały, że częstym mechanizmem oporności na STI571 jest amplifikacja i nadekspresja genu BCR/ABL (le Coutre et al., 2000; Mahon et al., 2000). Nadekspresja glikoproteiny Pgp, produktu genu oporności wielolekowej (MDR), może również przyczyniać się do powstania fenotypu oporności. Około jedna trzecia pacjentów, u których dochodzi do nawrotu choroby po wstępnej odpowiedzi, ma amplifikację BCR/ABL (Gorre i in., 2001). Co ciekawe, połowa z tych pacjentów rozwinęła mutacje punktowe w domenie kinazowej ABL, które skutkują zmniejszoną wrażliwością na STI571 (Barthe i in., 2001; Gorre i in., 2001; Hochhaus i in., 2001). Przynajmniej jedna z mutacji punktowych znajduje się w miejscu przewidywanym jako miejsce kontaktu między kinazą ABL i STI571 (Gorre i in., 2001). Kilka mutacji punktowych znajduje się w resztach przylegających do punktów kontaktowych, podczas gdy inne znajdują się w pętli aktywacji kinazy (Barthe i in., 2001; Gorre i in., 2001; Hochhaus i in., 2001). Jednakże, mutacja lub amplifikacja BCR/ABL nie były powszechnie obserwowane u pacjentów z opornością de novo na STI571 i trwają badania mające na celu zidentyfikowanie mechanizmu pierwotnej oporności u tych pacjentów.

Zahamowanie aktywności kinazy receptora ABL, PDGF i c-kit przez STI571 może potencjalnie zakłócać normalne funkcje komórkowe. Jednak znikomy stopień działań niepożądanych obserwowanych w badaniach klinicznych STI571 sugeruje, że alternatywne szlaki mogą kompensować supresję normalnych kinaz ABL, PDGF i c-kit.

Inhibitory innych białek transdukcji sygnału

Inhibitory transferazy farnezylowej (FTI)

Strategia ta opiera się na założeniu, że aktywacja RAS odgrywa centralną rolę w transformacji leukemogennej przez BCR/ABL (Cortez i in., 1996; Goga et al., 1995; Mandanas et al., 1993; Pendergast et al., 1993; Puil et al., 1994; Sanchez-Garcia and Martin-Zanca, 1997; Sawyers et al., 1995; Senechal et al., 1996). Zahamowanie sygnalizacji RAS poprzez ekspresję dominującego-ujemnego RAS, zablokowanie funkcji białka adaptorowego Grb2 lub inkubację z oligonukleotydami antysensownymi do p21Ras, zapobiega transformacji BCR/ABL w kilku modelach linii komórkowych (Gishizky i wsp., 1995; Sawyers i wsp., 1995; Sakai i wsp., 1994; Skorski i wsp., 1994a). Funkcja Ras zależy od prawidłowej lokalizacji subkomórkowej w błonie plazmatycznej poprzez dodanie 15-węglowej grupy farnezylowej do Ras, reakcji katalizowanej przez enzym transferazę farnezylową (FPT) (Gutierrez i in., 1989; Hancock i in., 1989; Long i in., 2001; Reiss i in., 1990; Stokoe i in., 1994). Inhibitory transferazy farnezylowej (FTI) są klasą leków zaprojektowanych w celu specyficznego blokowania onkogennej sygnalizacji Ras i zależnej od Ras transformacji komórkowej (Gibbs i in., 1994). FTI zaburzają prenylację Ras i bez właściwej lokalizacji subkomórkowej Ras nie jest już onkogenny (Kato et al., 1992). W kilku badaniach wykazano silne działanie przeciwnowotworowe FTI in vitro przeciwko komórkom nowotworowym myszy i człowieka transformowanym Ras oraz in vivo przeciwko tworzeniu się nowotworów specyficznych dla Ras w transgenicznych i ksenograftowych modelach myszy (End, 1999; Gibbs et al., 1997; Kohl et al., 1993, 1994; Nagasu et al., 1995; Rowinsky et al., 1999). Jednakże, odnotowano, że FTI hamują również wzrost transformowanych komórek, które nie posiadają zmutowanego Ras, co sugeruje, że inne mechanizmy są również zaangażowane (Liu i in., 1998; Sepp-Lorenzino i in., 1995). Na przykład, w obecności inhibitorowych dawek FTI, niektóre substraty białkowe ulegają alternatywnej prenylacji przez transferazę białkową geranyl-geranyl. Jako alternatywnie prenylowana forma RhoB wywiera działanie antyproliferacyjne na transformowane komórki (Lebowitz i in., 1997; Lebowitz i Prendergast, 1998). Ten ostatni czynnik może być odpowiedzialny za efekt obserwowany przez FTI na proliferację komórek. Zachęcające badania wstępne udokumentowały, że FTI hamują in vitro proliferację komórek ALL i młodocianej przewlekłej białaczki szpikowej (JCML) (Emanuel et al., 2000). Przeprowadzono badanie I fazy z eskalacją dawki FTI R115777 u 35 dorosłych z opornymi i nawrotowymi ostrymi białaczkami (Karp et al., 2001). Odpowiedzi kliniczne wystąpiły u 29% z 34 ocenianych pacjentów, w tym dwie całkowite remisje. Wyniki tego badania dostarczają pierwszych dowodów na skuteczne hamowanie FT w komórkach nowotworowych in vivo i sugerują, że FTI może być obiecującą metodą przeciwbiałaczkową.

Ponadto, SCH66336, doustny FTI, silnie hamuje tworzenie kolonii w miękkim agarze, spowalnia proliferację i uwrażliwia linie komórkowe BCR/ABL+ na bodźce apoptotyczne (Peters et al., 2001). Po podaniu myszom z białaczką indukowaną przez BCR/ABL, SCH66336 zwiększył przeżywalność z 4 tygodni (bez terapii) do ponad roku. Jednakże, gdy SCH66336 został wycofany zwierzęta rozwijały białaczkę. Wykazano również zdolność SCH66336 do hamowania tworzenia kolonii pierwotnych komórek CML (Peters et al., 2001). Wyniki te pokazują, że związki FTI są wysoce skuteczne jako pojedyncze środki przeciwko komórkom hematopoetycznym transformowanym przez BCR/ABL, identyfikując FTI jako potencjalne leczenie kliniczne białaczki indukowanej przez BCR/ABL. W innym badaniu wykazano skuteczność SCH66336 w leczeniu BCR/ABL-dodatniej ostrej białaczki limfoblastycznej u myszy transgenicznych P190 (Reichert et al., 2001). Dalsze badania przedkliniczne na zwierzętach określą zalety stosowania FTI w połączeniu z innymi metodami leczenia, takimi jak inhibitory kinaz tyrozynowych, w leczeniu białaczki wywołanej przez BCR/ABL.

Inhibitory proteasomu

Proteasom jest proteazą wielokatalityczną obecną we wszystkich komórkach eukariotycznych i stanowi podstawowy składnik szlaku degradacji białek w komórce. Poprzez degradację białek regulatorowych (An et al., 2000; Dietrich et al., 1996; Pagano et al., 1995; Wu et al., 2000), proteasom jest kluczem do aktywacji lub represji wielu procesów komórkowych, w tym progresji cyklu komórkowego i apoptozy (Adams et al., 1999; Imajoh-Ohmi et al., 1995). Badania in vitro i ksenograficzne na myszach wykazały aktywność przeciwnowotworową inhibitorów proteasomu w różnych typach nowotworów, w tym w raku trzustki, prostaty, jelita grubego, szpiczaku i przewlekłej białaczce limfocytowej (Adams, 2002; Hideshima i in., 2001; Shah i in., 2001). W kilku badaniach sprawdzano hipotezę, że proteasom może odgrywać rolę w regulacji funkcji BCR/ABL. Efekty działania inhibitorów proteasomu, takich jak aldehydy trójpeptydowe, laktacystyna i PSI, były badane w różnych ludzkich białaczkowych liniach komórkowych. Inhibicja proteasomu powoduje nasilenie śmierci apoptotycznej i wzmocnienie działania leków cytotoksycznych w wielu liniach komórek szpikowych (Dou i in., 1999; Drexler, 1997; Shinohara i in., 1996; Soligo i in., 2001). Proces ten obejmuje aktywację kaspaz, zaburzenie ekspresji białek z rodziny Bcl-2 oraz zmniejszenie ekspresji p210BCR/ABL. Co ciekawe, inhibitory proteasomu najpierw obniżają poziom aktywności kinazy tyrozynowej p210BCR/ABL, a następnie aktywują program śmierci apoptotycznej w komórkach K562 (Soligo i in., 2001). Wyniki te sugerują, że inaktywacja funkcji BCR/ABL przez inhibitory proteasomu jest niezbędna do indukcji apoptozy w białaczkowych liniach komórkowych. W komórkach pierwotnych, wrażliwość na PSI jest trzykrotnie wyższa w progenitorach CML CD34+ niż w normalnych progenitorach. Obserwacja, że transformowane komórki są bardziej wrażliwe na blokadę proteasomu niż normalne komórki, została zgłoszona w komórkach białaczkowych w porównaniu z normalnymi komórkami (Adams, 2002). Chociaż dokładny mechanizm tej różnej podatności nie jest w pełni zrozumiały, inhibicja proteasomu może odwrócić niektóre ze zmian, które umożliwiają proliferację i hamują apoptozę w komórkach złośliwych. Inhibitor proteasomu PS-341 był pierwszym inhibitorem proteasomu, który został wprowadzony do badań klinicznych u ludzi. Sześć badań klinicznych I fazy dla PS-341 w nowotworach złośliwych układu krwiotwórczego lub guzach litych zostało zakończonych lub jest w trakcie (Papandreou i in., 2001; Stinchcombe i in., 2000), a bezpieczeństwo i skuteczność leczenia PS-341 dla opornego szpiczaka mnogiego i CLL są testowane w dwóch trwających badaniach fazy II.

Immunomodulacja

To będzie tylko krótko omówione i odsyłamy czytelników do doskonałych przeglądów, które zostały ostatnio opublikowane (Apperley et al., 1998; Campbell et al., 2001; Clark and Christmas, 2001; Claxton et al., 2001; Dazzi et al., 1999; Goodman et al., 1998; Pinilla-Ibarz et al., 2000b).

Infuzja limfocytów dawcy u pacjentów z CML, u których doszło do nawrotu po allogenicznym przeszczepieniu komórek macierzystych (SCT), znacząco zwiększa odsetek długotrwałych remisji (Kolb et al., 1995). Chociaż mechanizm nie jest do końca poznany, dowodzi to, że komórki immunoregulacyjne mogą specyficznie eliminować białaczkowe komórki progenitorowe i macierzyste. GVHD związane z tą terapią stanowi główne ograniczenie tej terapii. Jednakże selektywna deplecja limfocytów T CD8+ dawcy lub transdukcja limfocytów T dawcy genem kinazy tymidynowej herpes simplex może pozwolić klinicystom na kontrolowanie GVHD (Ackerman i wsp., 1978; Barrett i wsp., 1998; Giralt i wsp., 1995; Nimer i wsp., 1994; Tiberghien i wsp., 1994). Kokultura limfocytów dawcy z komórkami białaczkowymi gospodarza lub prezentującymi antygen białaczkowymi komórkami dendrytycznymi od pacjentów z CML może być prowadzona w celu generowania i ekspansji CTL specyficznie reagujących przeciwko progenitorom CML (Choudhury i wsp., 1997; Faber i wsp., 1995; Falkenburg i wsp., 1993; Jiang i Barrett, 1995; Molldrem i wsp., 1997; Warren i wsp., 1998) ex vivo. Innym cennym podejściem jest opracowanie szczepionek przeciwko CML. W tej terapii peptydy specyficzne dla BCR/ABL ulegają ekspresji na cząsteczkach MHC w celu wygenerowania odpowiedzi CTL specyficznej dla białaczki. W kilku badaniach wykazano rozwój swoistej odpowiedzi immunologicznej. Nie wiadomo jeszcze, czy takie szczepionki wystarczą do skutecznego leczenia CML (Bocchia i wsp., 1995, 1996; Bosch i wsp., 1996; Pinilla-Ibarz i wsp., 2000a; ten Bosch i wsp, 1999).

Podawanie niskich lub pośrednich dawek IL2 po allogenicznym SCT lub ekspansja ex vivo autologicznych komórek NK z IL2 przed reinfuzją zwiększa liczbę i aktywację komórek NK u chorych na CML i może być pomocne w eliminacji minimalnej choroby resztkowej (Robinson i wsp., 1996; Soiffer i wsp., 1994; Vey i wsp., 1999).

Współpraca z innymi komórkami NK w CML może być pomocna w eliminacji minimalnej choroby resztkowej (Robinson i wsp., 1996; Soiffer i wsp., 1994; Vey i wsp., 1999).