Glycolysis

Rysunek 1. Szlaki glikolityczne u Escherichia coli. Ścieżka najdalej po lewej stronie to ścieżka Emden-Meyerhof-Parnas; ścieżka najdalej po prawej stronie to ścieżka Entner-Doudoroff. Geny, które kodują główne enzymy tych szlaków są zaznaczone kursywą. Pogrubione strzałki wskazują na produkcję lub konsumpcję wiązań wysokoenergetycznych (w formie ATP lub PEP) lub mocy redukującej (jako NADH lub NADPH). Zakrzywiona, pogrubiona linia u góry rysunku przedstawia błonę cytoplazmatyczną; reakcje powyżej tej zakrzywionej linii zachodzą w peryplazmie, a te poniżej – w cytoplazmie.

Scieżka EMP jest obecna u organizmów z każdej gałęzi bakterii, archaizmów i eukariontów. Wyraźnie widać, że jest to wczesna adaptacja ewolucyjna, prawdopodobnie obecna u przodka wszystkich obecnych form życia. Sugeruje to, że szlak EMP wyewoluował w beztlenowym, fermentacyjnym świecie. Jednakże szlak ten funkcjonuje również wydajnie jako podstawa tlenowego oddychania glukozy. Różnice między fermentacją a oddychaniem polegają głównie na odmiennym przeznaczeniu produkowanego pirogronianu (patrz dalej). Dla uproszczenia, niniejsza dyskusja koncentruje się na szlaku EMP u dobrze znanej bakterii Escherichia coli, choć podstawowe cechy tego szlaku są niemal uniwersalne.

Zanim rozpocznie się metabolizm glukozy, musi ona zostać przetransportowana do komórki i ulec fosforylacji. W E. coli te dwa procesy są ze sobą ściśle powiązane, tak że glukoza jest fosforylowana przez system fosfotransferaz (PTS), gdy wchodzi do komórki. Ponieważ glukozo-6-fosforan (G-6-P), jak większość, jeśli nie wszystkie fosforany cukrowe, jest toksyczny w wysokich stężeniach komórkowych, ten proces transportu jest ściśle regulowany. Transkrypcja genu transportera glukozy, ptsG, jest maksymalna tylko wtedy, gdy gromadzi się cykliczny adenozyno-monofosforan (cAMP) (sygnalizujący ograniczenie energii). Co więcej, translacja messenger RNA (mRNA) ptsG jest hamowana przez mały RNA sgrS, który jest produkowany podczas akumulacji G-6-P. W ten sposób import i towarzysząca mu fosforylacja do G-6-P jest zmniejszona, gdy zapotrzebowanie na więcej energii jest niskie lub gdy stężenie G-6-P jest niebezpiecznie wysokie.

W przypadku braku białka PtsG, inne transportery związane z PTS, zwłaszcza transporter specyficzny dla mannozy, ManXYZ, mogą również transportować i fosforylować glukozę. Jednakże mutanty ptsG rosną wolniej na glukozie niż szczepy typu dzikiego. Wolna glukoza może również gromadzić się wewnątrzkomórkowo w wyniku degradacji oligosacharydów zawierających glukozę, takich jak laktoza czy maltoza. Wejście wewnątrzkomórkowej glukozy do szlaku EMP odbywa się za pośrednictwem heksokinazy kodowanej przez gen glk.

Następne dwa etapy w szlaku EMP przygotowują G-6-P do rozszczepienia na dwa fosforany triozy. Po pierwsze, odwracalna izomeraza fosfoglukozy (gen pgi) przekształca G-6-P do fruktozo-6-fosforanu. Mutant pgi może nadal wolno rosnąć na glukozie, wykorzystując inne szlaki glikolityczne (patrz dalej), ale szlak EMP jest u niego zablokowany. Powstały fruktozo-6-fosforan jest dalej fosforylowany w pozycji C1 do fruktozo-1,6,-bisfosforanu kosztem adenozynotrójfosforanu (ATP) przez fosfofruktokinazę kodowaną przez pfkA. Drugi, mniejszy izozym fosfofruktokinazy kodowany przez pfkB umożliwia powolny wzrost mutantów pfkA. Potencjalnie konkurujący zestaw fosfataz, które usuwają fosforan C1 z fruktozo-1,6,-bisfosforanu, funkcjonuje podczas glukoneogenezy, ale jest kontrolowany podczas glikolizy przez różne mechanizmy sprzężenia zwrotnego, aby zapobiec bezużytecznemu cyklowi.

Kolejną reakcją w szlaku jest rozszczepienie fruktozo-1,6-bisfosforanu do dwóch fosforanów triozy, co nadaje szlakowi jego nazwę (glikoliza = rozpad cukru). Ta odwracalna reakcja jest przeprowadzana przez aldolazę bisfosforanu fruktozy (gen fbaA) i prowadzi do powstania fosforanu dihydroksyacetonu (DHAP) i fosforanu gliceraldehydu (GAP) jako produktów. Druga, niespokrewniona aldolaza (gen fbaB) jest wytwarzana tylko podczas glukoneogenezy, a więc nie odgrywa żadnej roli w glikolizie. Oba fosforany triozy są swobodnie konwertowane przez izomerazę triozofosforanową (gen tpi). DHAP jest kluczowym substratem dla biosyntezy lipidów. GAP jest ważnym węzłem w glikolizie; dwa inne wspólne szlaki glikolityczne (patrz niżej) łączą się ze szlakiem EMP w GAP.

Do tego momentu szlak EMP może być uważany za szlak biosyntetyczny, ponieważ wytwarza trzy kluczowe biosyntetyczne bloki budulcowe (G-6-P, fruktozo-6-fosforan i DHAP) kosztem ATP i bez żadnych etapów oksydacyjnych. Kolejnym etapem jest oksydacyjna fosforylacja GAP do kwasu 1,3-difosfoglicerynowego, związku wysokoenergetycznego. Wbudowanie fosforanu nieorganicznego przez dehydrogenazę GAP (gen gapA) jest połączone z redukcją NAD+ do NADH. W warunkach tlenowych NADH jest ponownie utleniany przez łańcuch oddechowy i powstaje ATP. W warunkach beztlenowych NADH jest ponownie utleniany poprzez sprzężenie z redukcją produktów pochodzących z pirogronianu lub innych produktów pośrednich szlaku EMP. Następnie enzym kinaza fosfoglicerynianowa (gen pgk) fosforyluje difosforan adenozyny (ADP) do ATP kosztem fosforanu C1 1,3-difosfoglicerynianu. Jest to pierwsza z dwóch fosforylacji na poziomie substratu, w której fosforan jest przenoszony z wysoce reaktywnego substratu bezpośrednio do ADP bez udziału błonowej syntazy ATP.

Następne dwa etapy przekształcają powstały 3-fosfoglicerynian w ostatni wysokoenergetyczny półprodukt szlaku, fosfoenolopirogronian (PEP). Po pierwsze, fosforan jest przenoszony z pozycji C3 na pozycję C2 przez mutazę fosfoglicerynianową. Istnieją dwie ewolucyjnie niepowiązane izozymy, z których jedna (kodowana przez gen gpmA) wymaga 2,3-bisfosfoglicerynianu jako kofaktora, a druga (gen gpmM) nie. Chociaż E. coli, Bacillus subtilis i niektóre inne bakterie mają oba izozymy, wiele organizmów ma tylko jeden lub drugi. Na przykład, drożdże Saccharomyces cerevisiae, bakteria Mycobacterium tuberculosis i wszystkie kręgowce mają tylko enzym zależny od kofaktora, podczas gdy rośliny wyższe, archaea i bakteria Pseudomonas syringae mają tylko enzym niezależny od kofaktora. Trzeci izozym (gen ytjC) wydaje się istnieć w E. coli, choć jego rola jest mniej jasna.

Przestawiony 2-fosfoglicerynian jest następnie odwadniany przez enolazę (gen eno) w celu uzyskania kluczowego półproduktu, PEP. Chociaż pirogronian jest powszechnie uważany za produkt końcowy szlaku EMP, można argumentować, że PEP dzieli ten zaszczyt. PEP jest ostatecznym źródłem fosforanu dla zapoczątkowującego szlak transportu/fosforylacji glukozy z udziałem PtsG. Ponadto, enzym enolaza jest wymaganą częścią degradasomu, który funkcjonuje z małym RNA sgrS (opisanym wcześniej) w celu hamowania translacji mRNA ptsG i stymulowania degradacji mRNA ptsG. Zmniejsza to generowanie toksycznej skądinąd kumulacji G-6-P.

Warto zauważyć, że PEP jest punktem rozgałęzienia zarówno w warunkach tlenowych, jak i beztlenowych. Karboksylacja PEP przez karboksylazę PEP (gen ppc) prowadzi do powstania oksalooctanu, który kondensuje z acetylo-CoA pochodzącym z pirogronianu, tworząc cytrynian, niezbędny do uruchomienia zarówno cyklu kwasu trójkarboksylowego (TCA), jak i bocznika glioksylanowego w warunkach tlenowych. Podczas fermentacji ten sam oksalooctan jest półproduktem w ścieżce redukcyjnej (regenerującej NAD) do bursztynianu. Ponadto, oksalooctan pochodzący z PEP jest wykorzystywany (poprzez część cyklu TCA) do biosyntezy kwasu glutaminowego nawet w warunkach beztlenowych.

Ostatnia reakcja to fosforylacja ADP do ATP na poziomie substratu kosztem PEP w celu uzyskania pirogronianu. Dwie izozymy kinazy pirogronianowej (geny pykA i pykF) są aktywowane przez fosforany cukrów, a produkt genu pykF wykazuje pozytywną kooperatywność w stosunku do substratu PEP, co ponownie zapobiega akumulacji tego fosforylowanego pośredniego produktu, a tym samym generowaniu większej ilości G-6-P poprzez zależny od PEP mechanizm transportu PtsG.

Na końcu szlaku EMP, 1 mol glukozy jest przekształcany w 2 mol pirogronianu, który może być użyty do dalszego katabolizmu lub biosyntezy. Powstaje również 2 mol ATP i 2 mol NADH (który musi być ponownie utleniony, aby szlak mógł dalej działać). Ponieważ szlak ten generuje kilka toksycznych produktów pośrednich, nie jest zaskakujące, że przepływ przez szlak jest ściśle regulowany. Enzymy szlaku szybko reagują na zmiany w podaży i popycie poprzez zwrotne hamowanie i aktywację substratów aktywności enzymów. Odpowiadają one również (wolniej) poprzez transkrypcyjną regulację ekspresji genów w odpowiedzi na globalne regulatory, które różnią się w zależności od organizmu.

Scieżka EMP funkcjonuje w celu generowania zarówno pośrednich produktów biosyntezy, jak i energii katabolicznej z glukozy. Jednakże służy on również jako centralny pień, do którego doprowadza wiele innych szlaków katabolicznych. G-6-P, fruktozo-6-fosforan, DHAP i GAP to wspólne punkty węzłowe, w których szlaki kataboliczne dla cukrów, alkoholi, tłuszczów i kwasów organicznych zasilają szlak EMP.

.