PMC

3. Dyskusja

DT większości bakterii w ich naturalnym środowisku nie jest znany. Użyliśmy szacunków tempa, w którym bakterie gromadzą mutacje w ich naturalnym środowisku i szacunków tempa, w którym mutują w laboratorium, aby oszacować DT dla kilku bakterii i wywnioskować dystrybucję DT wśród bakterii. Szacujemy, że DT są ogólnie dłuższe w naturze niż w laboratorium, ale krytycznie wnioskujemy również, że DT różnią się o kilka rzędów wielkości pomiędzy gatunkami bakterii i że wiele bakterii ma bardzo powolne DT w ich naturalnym środowisku.

Metoda, dzięki której wnioskowaliśmy o DT w naturze, czyni trzy ważne założenia. Zakładamy, że tempo mutacji na pokolenie jest takie samo w laboratorium i w środowisku naturalnym. Jednakże, wydaje się prawdopodobne, że bakterie w środowisku naturalnym będą miały wyższy wskaźnik mutacji na pokolenie niż te w laboratorium z dwóch powodów. Po pierwsze, bakterie w środowisku naturalnym prawdopodobnie będą poddane stresowi i można się spodziewać, że podniesie to współczynnik mutacji. Po drugie, jeżeli zakładamy, że DTs są dłuższe w przyrodzie niż w laboratorium, wówczas oczekujemy, że wskaźnik mutacji na pokolenie będzie wyższy w przyrodzie niż w laboratorium, ponieważ niektóre procesy mutacyjne nie zależą od replikacji DNA. Względny wkład zależnych od replikacji oraz niezależnych mechanizmów mutacyjnych do ogólnego tempa mutacji jest nieznany. Tempo substytucji jest wyższe w Firmicutes, które nie ulegają sporulacji, co sugeruje, że replikacja jest źródłem mutacji w tej grupie bakterii. Jednakże, wskaźniki akumulacji mutacji wydają się być podobne w utajonych versus aktywnych infekcjach Mycobacterium tuberculosis, sugerując, że mutacje niezależne od replikacji mogą dominować w tej bakterii.

Drugim głównym założeniem jest to, że tempo, w którym mutacje akumulują się w przyrodzie jest równe tempu mutacji na rok; w efekcie zakładamy, że wszystkie mutacje są efektywnie neutralne, przynajmniej w czasie, w którym są badane (lub, że niektóre są unieszkodliwione, ale ta sama proporcja jest unieszkodliwiona w przyrodzie i w laboratorium). W tych badaniach szybkości akumulacji, w których były one badane oddzielnie, mutacje niesynonimiczne akumulują się wolniej niż mutacje synonimiczne; względne szybkości wahają się od 0,13 do 0,8, ze średnią 0,57 (elektroniczny materiał uzupełniający, tabela S3). Nie ma korelacji między ramą czasową, w której dokonano oszacowania, a stosunkiem szybkości akumulacji mutacji niesynonimicznych i synonimicznych (r = 0,2, p = 0,53). Nie próbowaliśmy kontrolować selekcji, ponieważ względne wskaźniki akumulacji synonimicznej i niesynonimicznej są dostępne tylko dla kilku gatunków, a względne wskaźniki różnią się między gatunkami. Możemy jednak oszacować stopień, w jakim większa selekcja przeciwko delektywnej akumulacji niesynonimicznej w naturze powoduje niedoszacowanie DT w następujący sposób. Obserwowana szybkość, z jaką mutacje akumulują się w linii bakteryjnej wynosi

3.1

gdzie α jest proporcją genomu, który jest niekodujący, a β jest proporcją mutacji w sekwencji kodującej białka, które są niesynonimiczne. δx jest proporcją mutacji klasy x (i jest intergeniczne, s jest synonimiczne i n jest niesynonimiczne), które są efektywnie neutralne. α i β są w przybliżeniu 0,15 i 0,7, odpowiednio, w naszym zestawie danych. Chociaż istnieje selekcja na synonimiczne użycie kodonów w wielu bakteriach, selekcja wydaje się być słaba, dlatego zakładamy, że δs = 1. To implikuje, z szybkości, przy której mutacje niesynonimiczne gromadzą się w stosunku do mutacji synonimicznych, że δn = 0.6. Ostatnia analiza regionów intergenicznych w kilku gatunkach bakterii wykazała, że selekcja jest słabsza w regionach intergenicznych niż w miejscach niesynonimicznych; dlatego zakładamy, że δi = 0.8 . Użycie tych szacunków sugeruje, że selekcja prowadzi nas do niedoszacowania prawdziwego tempa mutacji na rok w przyrodzie o około 27%; to z kolei oznacza, że przeszacowaliśmy DT o około 37%, co jest stosunkowo niewielkim efektem. Aby zbadać jak wrażliwe jest to oszacowanie na parametry w równaniu 1, zmieniliśmy każdy z nich po kolei (elektroniczny materiał uzupełniający, tabela S4). Stwierdziliśmy, że obserwowany wskaźnik mutacji jest najbardziej wrażliwy na selekcję na synonimiczne użycie kodonów, ponieważ jeśli istnieje selekcja na synonimiczne użycie kodonów, wpływa to również na nasze szacunki selekcji w miejscach niesynonimicznych i w intergenicznych. Na przykład, jeśli selekcja na synonimicznym użyciu kodonu obniżyła tempo akumulacji synonimicznej o 0.5, doprowadziłoby to do niedoszacowania tempa mutacji o 63%, co z kolei doprowadziłoby do 2.7-krotnego przeszacowania DT.

Wreszcie, chociaż każde badanie próbowało usunąć polimorfizmy pojedynczego nukleotydu (SNPs), które powstały przez rekombinację, możliwe jest, że niektóre z nich są nadal obecne w danych. Rekombinowane SNP mogą mieć dwa efekty. Po pierwsze, jeśli uległy one rekombinacji spoza kladu, zwiększają szacunkową wartość współczynnika akumulacji, a tym samym prowadzą do niedoszacowania DT. Po drugie, jeśli rekombinacja zachodzi w obrębie kladu, wpływają one na filogenezę i potencjalnie prowadzą do tego, że korzeń drzewa jest szacowany jako młodszy niż powinien być. Doprowadzi to do przeszacowania DT.

Ważne jest, aby docenić, że nasza metoda szacuje średni DT w określonym środowisku, z którego pobrano próbki bakterii. Bakteria może przechodzić przez okresy spoczynku przeplatane okresami wzrostu.

Mimo założeń, które przyjęliśmy w naszej metodzie, nasze oszacowanie DT Pseudomonas aruginosa wynoszącego 2,3 h u pacjenta z mukowiscydozą jest bardzo podobne do tego niezależnie oszacowanego przy użyciu zawartości rybosomów w komórkach, wynoszącego od 1,9 do 2,4 h. Istnieją również niezależne dowody, że istnieją bakterie, które dzielą się powoli w swoim naturalnym środowisku. Szacuje się, że symbiont mszyc Buchnera aphidicola podwaja się co 175-292 h w swoim gospodarzu, a Mycobacterium leprae podwaja się co 300-600 h na opuszkach stóp myszy, nie jest to jej naturalne środowisko, ale prawdopodobnie podobne do ludzkiej skóry. Ponadto, w niedawnym eksperymencie selekcyjnym, Avrani et al. odkryli, że kilka populacji E. coli, które były głodzone z zasobów, gromadziło mutacje w genie polimerazy RNA rdzenia. Mutacje te powodowały, że szczepy te dzieliły się wolniej niż szczepy niezmutowane, gdy zasoby były obfite. Co ciekawe, te same mutacje występują z dużą częstotliwością u bakterii niekulturowych, co sugeruje, że istnieje klasa wolno rosnących bakterii w środowisku, które są przystosowane do głodu.

Korem et al. zaproponowali ostatnio ogólną metodę, dzięki której DT może być potencjalnie oszacowany. Zauważyli, że aktywnie replikujące się komórki bakteryjne mają dwie lub więcej kopii chromosomu w pobliżu początku replikacji, ale tylko jedną kopię w pobliżu końca, jeśli podział komórki następuje szybko po zakończeniu replikacji DNA. Wykorzystując sekwencjonowanie następnej generacji, wykazali, że możliwe jest oznaczenie tego sygnału i że stosunek głębokości sekwencjonowania w pobliżu początku i końca jest skorelowany z tempem wzrostu bakterii in vivo. Brown i wsp. rozszerzyli tę metodę na bakterie bez genomu referencyjnego i/lub te, które nie mają znanego początku i końca replikacji. W zasadzie, te miary komórek wykonujących replikację DNA mogłyby być wykorzystane do oszacowania DT bakterii w środowisku naturalnym. Nie jest jednak jasne, w jaki sposób lub czy metody te mogą być kalibrowane. Zarówno Korem et al. (2015) jak i Brown et al. (2016) stwierdzają, że ich miary replikacji mają medianę około 1,3 wśród bakterii w jelicie człowieka. Jednak wartość 1,3 przekłada się na różne wartości względne i bezwzględne DT w obu badaniach. Brown et al. pokazują, że ich miara replikacji, iRep, jest wysoce skorelowana z miarą Korem et al., PTR, dla danych z Lactobacillus gasseri; równanie odnoszące się do tych dwóch statystyk to iRep = -0,75 + 2 PTR. Stąd, gdy PTR = 1,3, iRep = 1,85, a gdy iRep = 1,3, PTR = 1,03. Te dwie metody nie są spójne. Dają one również bardzo różne szacunki dla bezwzględnego DT. Korem i wsp. wykazują, że PTR jest silnie skorelowana z tempem wzrostu E. coli hodowanej w chemostacie. Jeśli przyjmiemy, że zależność pomiędzy PTR a tempem wzrostu jest taka sama dla bakterii in vivo i in vitro, to oznacza to, że mediana DT dla mikrobiomu ludzkiego wynosi około 2,5 h. Natomiast Brown i wsp. szacują tempo wzrostu Klebsiella oxytoca na 19,7 h u noworodka na podstawie liczenia kału i stwierdzają, że populacja ta ma wartość iRep około 1,77. Wartość ta jest większa niż dla zdecydowanej większości bakterii w mikrobiomie ludzkim i bakterii w Candidate Phyla Radiation, co sugeruje, że większość bakterii w tych dwóch społecznościach replikuje się bardzo wolno. Te rozbieżności pomiędzy dwiema metodami sugerują, że kalibracja metod PTR i iRep w celu uzyskania szacunkowych wartości DT dla wszystkich bakterii może nie być łatwa.

Wreszcie, jak powinniśmy interpretować nasze wyniki dla pięciu głównych gatunków w kontekście tego, co wiadomo o ich ekologii? Vibrio cholerae wykazuje najkrótszy DT wynoszący 1,1 h. Gatunki Vibrio są wszechobecne w środowisku estuaryjnym i morskim. Wiadomo, że mają bardzo krótki czas generacji w kulturze, najkrótszy z nich to Vibrio natriegens wynoszący zaledwie 9,8 min. W środowisku naturalnym mogą one wykorzystywać szeroki zakres źródeł węgla i energii, i jako takie zostały określone mianem „oportunityrofów”. Naturalne społeczności Vibrio nie rosną w przyspieszonym tempie w sposób ciągły, lecz mogą istnieć przez długie okresy w stanie półuśpienia, przerywanego szybkimi impulsami wysokiego tempa wzrostu lub zakwitami, gdy warunki są sprzyjające. Argumentowano również, że nietypowy podział genomów Vibrio na dwa chromosomy ułatwia szybszy wzrost. Wskazując na bardzo krótki DT w V. cholerae, nasza analiza jest zatem zgodna z tym, co wiadomo o ekologii tego gatunku.

Staphylococcus aureus występuje głównie na zwierzętach i ludziach i zasiedla różne części ciała, w tym skórę i górne drogi oddechowe . Może powodować zakażenia skóry i tkanek miękkich, jak również bakteriemię . Staphylococcus aureus wykazuje szereg trybów wzrostu, z których niektóre mogą pozwolić mu przetrwać stres i środki przeciwdrobnoustrojowe podczas gdy w swoim gospodarzu. Na przykład, małe subpopulacje mogą przyjąć powolny wzrost, quasi uśpiony tryb życia, albo w wielokomórkowym biofilmie, albo jako małe warianty kolonii (SCVs) lub komórki persister . Nasz krótki DT wynoszący 1,8 h sugeruje, że nie jest to typowy stan dla S. aureus w środowisku naturalnym, co nie jest zaskakujące, biorąc pod uwagę, że częstość występowania SCV w próbkach klinicznych jest dość niska, pomiędzy 1 a 30% .

Pseudomonas aeruginosa może zamieszkiwać wiele różnych środowisk, w tym glebę, wodę, rośliny i zwierzęta. Podobnie jak inne nasze gatunki ogniskowe, jest patogenem oportunistycznym i może również zakażać ludzi, szczególnie tych z osłabionym układem odpornościowym, takich jak pacjenci z mukowiscydozą. W tym kontekście infekcja ma charakter przewlekły. Równoległa ewolucja, zróżnicowana regulacja genów, które umożliwiają mu omijanie układu odpornościowego gospodarza i oporność na leczenie antybiotykami podczas infekcji, a także dowody na pozytywną selekcję sugerują, że P. aeruginosa może przystosować się do płuc osób z mukowiscydozą w celu zapewnienia sobie długoterminowego przetrwania. Wiadomo, że aktywnie rośnie w plwocinie, gdzie wykorzystuje dostępne odżywianie, które wspiera jego wzrost do wysokich gęstości populacji . Jego zdolność do adaptacji i aktywnego wzrostu w plwocinie CF jest zgodna z jego stosunkowo krótkim DT 2,3 h, zwłaszcza biorąc pod uwagę, że jest to środowisko, w którym szybkość akumulacji została zmierzona i pasuje do tego oszacowanego przez Yang et al. .

Escherichia coli i S. enterica przede wszystkim zamieszkują w dolnej części jelita ludzi i zwierząt, ale mogą również przetrwać w środowisku. Chociaż E. coli jest powszechnie odzyskiwana z próbek środowiskowych, nie uważa się, aby była w stanie rosnąć lub przetrwać przez dłuższy czas poza wnętrznościami ciepłokrwistych zwierząt, z wyjątkiem regionów tropikalnych, gdzie warunki są bardziej korzystne, chociaż niektóre filogenetycznie odrębne szczepy wydają się dobrze rozmnażać i przetrwać w środowisku. Z kolei Salmonella jest również kolonizatorem jelit zwierząt zimnokrwistych, w szczególności gadów, jest lepiej przystosowana niż E. coli do przetrwania i wzrostu w niszach środowiskowych. Na przykład, Salmonella może przetrwać i rosnąć w glebie przez co najmniej rok, podczas gdy E. coli może przetrwać tylko kilka dni. Chociaż te nisze wtórne mogą odgrywać większą rolę w Salmonella niż w E. coli, pozostaje faktem, że tempo wzrostu w środowisku będzie znacznie niższe niż w jelicie. Dlatego też zwiększona wytrwałość Salmonelli w środowiskach innych niż środowisko żywiciela w porównaniu do E. coli może pomóc wyjaśnić wolniejszy DT u tego gatunku.

Podsumowując, dostępność szacunków dotyczących akumulacji i szybkości mutacji pozwala nam wnioskować o DT dla bakterii w środowisku naturalnym oraz o dystrybucji dzikich DT wśród gatunków bakterii. Te szacunki DT są prawdopodobnie niedoszacowane, ponieważ oczekuje się, że tempo mutacji na pokolenie będzie wyższe w środowisku naturalnym niż w laboratorium, a niektóre mutacje nie są generowane przez replikację DNA. Nasza analiza sugeruje zatem, że DT w naturze są zazwyczaj dłuższe niż te w laboratorium, że różnią się one znacznie pomiędzy gatunkami bakterii i że znaczna część gatunków ma bardzo długie DT w naturze.