Primer (biologia molekularna)
Syntetyczne startery są chemicznie syntetyzowanymi oligonukleotydami, zwykle DNA, które można dostosować do annealii do określonego miejsca na szablonowym DNA. W roztworze, starter spontanicznie hybrydyzuje z szablonem poprzez parowanie zasad Watsona-Cricka, zanim zostanie przedłużony przez polimerazę DNA. Zdolność do tworzenia i dostosowywania syntetycznych primerów okazała się nieocenionym narzędziem niezbędnym w różnych metodach biologii molekularnej obejmujących analizę DNA. Zarówno metoda terminacji łańcuchowej Sangera jak i metoda sekwencjonowania DNA „Next-Gen” wymagają starterów do zainicjowania reakcji.
Projektowanie starterów PCREdit
Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) wykorzystuje parę niestandardowych starterów do kierowania wydłużaniem DNA w kierunku siebie nawzajem na przeciwległych końcach amplifikowanej sekwencji. Startery te mają zazwyczaj długość od 18 do 24 zasad i muszą kodować tylko specyficzne miejsca upstream i downstream amplifikowanej sekwencji. Starter, który może wiązać się z wieloma regionami wzdłuż DNA, będzie amplifikował je wszystkie, eliminując cel PCR.
Kilka kryteriów musi być branych pod uwagę przy projektowaniu pary starterów PCR. Pary primerów powinny mieć podobne temperatury topnienia, ponieważ annealing podczas PCR zachodzi dla obu nici jednocześnie, a ta wspólna temperatura topnienia nie może być ani zbytnio wyższa, ani niższa od temperatury annealingu reakcji. Starter z Tm (temperaturą topnienia) zbytnio wyższą niż temperatura annealingu reakcji może źle zhybrydyzować i przedłużyć się w niewłaściwym miejscu wzdłuż sekwencji DNA. Tm znacznie niższa od temperatury annealingu może nie zdążyć się zsynchronizować i rozszerzyć w ogóle.
Dodatkowo, sekwencje primerów muszą być tak dobrane, aby jednoznacznie wybrać region DNA, unikając możliwości hybrydyzacji do podobnej sekwencji w pobliżu. Powszechnie stosowaną metodą wyboru miejsca primera jest wyszukiwanie metodą BLAST, dzięki której można zobaczyć wszystkie możliwe regiony, z którymi primer może się związać. Zarówno sekwencja nukleotydowa, jak i sam primer mogą być przeszukiwane metodą BLAST. Darmowe narzędzie NCBI Primer-BLAST integruje projektowanie starterów i wyszukiwanie BLAST w jednej aplikacji, podobnie jak komercyjne oprogramowanie takie jak ePrime i Beacon Designer. Symulacje komputerowe teoretycznych wyników PCR (Electronic PCR) mogą być wykonane w celu pomocy w projektowaniu primerów poprzez podanie temperatur topnienia i annealingu, itp.
Wiele narzędzi online jest dostępnych za darmo do projektowania primerów, niektóre z nich koncentrują się na konkretnych zastosowaniach PCR. Popularne narzędzia Primer3Plus i PrimerQuest mogą być użyte do znalezienia primerów odpowiadających szerokiej gamie specyfikacji. Wysoce zdegenerowane startery do wielu różnych szablonów DNA mogą być interaktywnie zaprojektowane przy użyciu GeneFISHER. Primery o wysokiej specyficzności dla podzbioru szablonów DNA w obecności wielu podobnych wariantów mogą być zaprojektowane przy użyciu programu DECIPHER. Projektowanie starterów ma na celu uzyskanie równowagi pomiędzy specyficznością a wydajnością amplifikacji.
Wybór specyficznego regionu DNA do wiązania starterów wymaga pewnych dodatkowych rozważań. Należy unikać regionów o dużej ilości powtórzeń mononukleotydowych i dinukleotydowych, ponieważ może dojść do tworzenia pętli, co przyczynia się do błędnej hybrydyzacji. Primery nie powinny łatwo annealować z innymi primerami w mieszaninie; zjawisko to może prowadzić do wytwarzania produktów „dimerów primerów” zanieczyszczających roztwór końcowy. Primery nie powinny również silnie annegować same do siebie, ponieważ wewnętrzne spinki i pętle mogą utrudniać annegację z szablonowym DNA.
Przy projektowaniu primerów, dodatkowe zasady nukleotydowe mogą być dodane do tylnych końców każdego primera, co skutkuje indywidualną sekwencją czapeczki na każdym końcu amplifikowanego regionu. Jednym z zastosowań tej praktyki jest klonowanie TA, specjalna technika subklonowania podobna do PCR, gdzie wydajność może być zwiększona przez dodanie ogonów AG do końców 5′ i 3′.
Prymery zdegenerowaneEdit
Niektóre sytuacje mogą wymagać zastosowania starterów zdegenerowanych. Są to mieszaniny starterów, które są podobne, ale nie identyczne. Mogą one być wygodne przy amplifikacji tego samego genu z różnych organizmów, ponieważ sekwencje są prawdopodobnie podobne, ale nie identyczne. Technika ta jest przydatna, ponieważ sam kod genetyczny jest zdegenerowany, co oznacza, że kilka różnych kodonów może kodować ten sam aminokwas. Dzięki temu różne organizmy mogą mieć znacząco różne sekwencje genetyczne, które kodują bardzo podobne białko. Z tego powodu, startery zdegenerowane są również używane, gdy projektowanie starterów oparte jest na sekwencji białka, ponieważ specyficzna sekwencja kodonów nie jest znana. Dlatego też, sekwencja primera odpowiadająca aminokwasowi izoleucynie może mieć postać „ATH”, gdzie A oznacza adeninę, T – tyminę, a H – adeninę, tyminę lub cytozynę, zgodnie z kodem genetycznym dla każdego kodonu, przy użyciu symboli IUPAC dla zdegenerowanych zasad. Startery zdegenerowane mogą nie hybrydyzować idealnie z sekwencją docelową, co może znacznie zmniejszyć specyficzność amplifikacji PCR.
Startery zdegenerowane są szeroko stosowane i niezwykle użyteczne w dziedzinie ekologii mikroorganizmów. Pozwalają one na amplifikację genów z dotychczas nieuprawianych mikroorganizmów lub umożliwiają odzyskanie genów z organizmów, o których nie ma informacji genomowej. Zazwyczaj startery zdegenerowane projektuje się poprzez wyrównanie sekwencji genów znajdujących się w GenBanku. Różnice między sekwencjami są uwzględniane poprzez zastosowanie degeneracji IUPAC dla poszczególnych zasad. Startery PCR są następnie syntetyzowane jako mieszanina starterów odpowiadających wszystkim permutacjom sekwencji kodonów.