Wszystko o agarze

Typ agaru	Krótki opis	Nadaje się do użytku przez uczniów?
Podłoże krwionośne	Zawiera komórki krwi zwierzęcia (np. owcy); większość bakterii będzie rosła na tym podłożu.	Nie, ze względu na możliwość skażenia w wyniku kontaktu z ludźmi.
Podłoże czekoladowe	Złożone z krwi owczej, która dostarcza czynników X i V niezbędnych do wzrostu Haemophilus, jest to podłoże odżywcze, które jest używane do hodowli szybko rosnących organizmów, takich jak Haemophilus species i Neisseria. Agar czekoladowy nie ujawnia jednak danych dotyczących hemolizy, dlatego różnicowanie gatunków wśród członków Haemophilus musi być przeprowadzane w inny sposób.	Nie, ze względu na możliwość skażenia w wyniku kontaktu z ludźmi.
LB (Luria Bertani) Agar	Podtyp agaru odżywczego, jest to ogólne podłoże do badań mikrobiologicznych i może być stosowane do rutynowej hodowli nieszczególnie wymagających mikroorganizmów. Nie powoduje również preferencyjnego wzrostu jednego rodzaju bakterii w stosunku do innych.	Tak.
MacConkey Agar	Jest to agar, na którym mogą rosnąć tylko bakterie Gram-ujemne. Co więcej, E.coli będzie rosła w czerwone kolonie, ponieważ jest tam obecny wskaźnik pH. Należy wspomnieć, że agar MacConkey w proszku występuje w dwóch wersjach: z dodatkiem cukru – laktozy i bez dodatku cukrów. Ponieważ E.coli fermentuje cukry do kwasów (stąd czerwony kolor), można dodać jeden z wielu różnych rodzajów cukrów do agaru MacConkey bez cukru i zobaczyć, czy rozwiną się czerwone kolonie. Jeśli uzyskasz czerwone kolonie, wiesz, że szczep E.coli, którego używasz, może używać tego cukru.	Nie, z powodu selektywności.
Miller’s LB Agar	Ta powszechna odmiana LB agar wydaje się mieć te same składniki co LB, tylko w innych proporcjach.	Tak, ale zalecane jest trzymanie się formuły generycznej.
Neomycin Agar	Zawiera antybiotyk neomycynę, która znajduje się w wielu lekach, takich jak kremy, maści i krople do oczu. Neomycyna została odkryta w 1949 roku przez mikrobiologa Selmana Waksmana i jest produkowana naturalnie przez bakterię Streptomyces fradiae. Ponadto neomycyna ma szerokie spektrum działania, zabijając zarówno bakterie gram-dodatnie, jak i gram ujemne. Jest stosunkowo toksyczna dla ludzi, a niektóre osoby mają na nią reakcje alergiczne. Agar z neomycyną jest często używany do hodowli organizmów w warunkach beztlenowych. Neomycyna zatrzymuje wzrost Gram-ujemnych pałeczek i gronkowców, pozwalając gatunkom Streptococcus na obfitszy wzrost.	Nie, ze względu na obawy dotyczące bezpieczeństwa.
Agar bez składników odżywczych	Zazwyczaj nie nadaje się do hodowli bakterii. Może być jednak stosowany do hodowli innych mikroorganizmów.	Nie.
Agar odżywczy	Wyhoduje największą liczbę różnych rodzajów mikrobów – grzybów i bakterii. Jednak nie wszystkie bakterie mogą na nich rosnąć. Niektóre uważają, że jest zbyt bogata, a inne, że jest niedoborowa. Składnikiem odżywczym jest bulion wołowy i niektóre ekstrakty z drożdży.	Tak.
Sabouraud Agar	Używany do grzybów i ma niskie pH, które zabije większość bakterii. Zawiera gentamycynę, która jest antybiotykiem aminoglikozydowym. Gentamycyna może również leczyć wiele różnych rodzajów infekcji bakteryjnych, w szczególności infekcji wywołanych przez bakterie Gram-ujemne.	Nie, ze względu na obawy dotyczące bezpieczeństwa.
Thayer-Martin Agar	Agar czekoladowy przeznaczony do izolowania Neisseria gonorrhoeae, znanej również jako „gonococcus”, która jest gatunkiem Gram-ujemnej bakterii odpowiedzialnej za chorobę rzeżączki.	Nie, ze względu na możliwość skażenia w wyniku kontaktu z ludźmi.
Agar z soją tryptyczną	Podłoże podstawowe używane do hodowli wielu rodzajów mikroorganizmów. Agar sojowy tryptyczny jest stosowany głównie jako wstępne podłoże wzrostowe w celu: obserwacji morfologii kolonii, uzyskania czystej kultury, uzyskania wzrostu wystarczającego do dalszych badań biochemicznych oraz przechowywania hodowli.	Tak.
XLD Agar	Agar z deoksycholanem lizyny i ksylozy. Jest stosowany do hodowli próbek kału i zawiera dwa wskaźniki. Jest tak opracowany, aby hamować wzrost bakterii Gram-dodatnich, podczas gdy wzrost pałeczek Gram-ujemnych jest stymulowany. Kolonie bakterii fermentujących laktozę są żółte.	Nie, z powodu selektywności.

Przygotowanie butelkowanego podłoża i płytek(5)

Doświadczenie wstępne:

Przechowywać sterylne płytki Petriego zamknięte do czasu, gdy będzie można wlać do nich agar. Zanieczyszczenia przenoszone przez powietrze mogą łatwo przedostać się do otwartej szalki Petriego.

Chociaż dostępne są wstępnie zalane płytki agarowe, można wykonać płytki agarowe z agaru w tabletkach, w proszku lub w butelkach, postępując zgodnie z kilkoma prostymi instrukcjami. Zestawy agarowe zazwyczaj zawierają szczegółowe instrukcje dotyczące przygotowania płytek, a poniżej znajdują się przykładowe procedury referencyjne. W razie wątpliwości należy dokładnie przeczytać instrukcję i w razie potrzeby poprosić o pomoc (skonsultować się z nauczycielem lub zadzwonić na linię pomocy technicznej dostawcy zestawu agarowego).

Przygotowanie Agaru w tabletkach lub w proszku:

Skład agaru LB (Luria Bertani) jest następujący: 9,1 g/L tryptonu, 4,6 g/L ekstraktu drożdżowego, 4,6 g/L NaCl, i 13,7 g/L agaru. W przypadku stosowania tabletek należy rozpuścić 10 tabletek na 500 ml wody. W przypadku agaru w proszku, rozpuścić w mikrofalówce 6,9 g agaru w 500 ml wody. 500 ml agaru wystarczy na ~ 25 dużych szalek Petriego (średnica 100 mm) lub 50 małych szalek Petriego (średnica 60 mm).

Przygotowanie agaru w butelce:

• Odkręć nakrętkę butelki, ale nie zdejmuj jej podczas podgrzewania.
• Ogrzewać butelkę z agarem w gorącej kąpieli wodnej lub w mikrofalówce, aż stanie się płynna.
• Po otwarciu nakrętki, przepuścić szyjkę butelki z agarem przez płomień, aby ją wysterylizować. Nie zgubić nakrętki!
• Podczas wlewania agaru, otwórz pokrywę szalki Petriego tak mało jak to możliwe, trzymaj ją pod kątem i upewnij się, że pokrywa jest trzymana bezpośrednio nad szalką Petriego.
• Wlać wystarczającą ilość rozpuszczonego agaru do każdej sterylnej plastikowej szalki Petriego, aby przykryć 1/8″ dna. Natychmiast przykryć pokrywkę płytki Petriego.
• Umieścić płytki z agarem na blacie do ostygnięcia i zastygnięcia. Podłoże agarowe w temperaturze pokojowej stężeje jak sztywna żelatyna.
• Przepuścić szyjkę butelki z agarem przez płomień ponownie przed nałożeniem nakrętki.

Przygotowanie wstępnie wylanych płytek:

Jeśli płytki były przechowywane w lodówce, należy je wyłożyć i pozwolić im ogrzać się do temperatury pokojowej.

Przechowywanie:

Płytki agarowe układać w lodówce do góry dnem. Nie zamrażać! Celem umieszczenia płytek do góry nogami jest zapobieganie skraplaniu się pary wodnej na powierzchni agaru, co mogłoby ułatwić przemieszczanie się organizmów między koloniami.

Proszę zapoznać się z http://www.umsl.edu/~microbes/pdf/tipsforplates.pdf w celu uzyskania dodatkowych wskazówek.

Dodatkowe względy bezpieczeństwa(6)

• Podczas mieszania roztworu bulionowego należy zwrócić szczególną uwagę na to, aby skalę mieszania rozpoczynać od niskich ustawień i od tego momentu zwiększać prędkość.
• Podczas podgrzewania bulionu, upewnij się, że przykryłeś kolbę w taki sposób, aby nie doprowadzić do wrzenia, ale aby uniknąć rozlania.
• Podczas nalewania bulionu, upewnij się, że wypełnisz szalkę Petriego bez poparzenia się. Ponadto ważne jest, aby w tym procesie upewnić się, że szalka Petriego jest natychmiast przykryta, aby umożliwić substancji do ostygnięcia proporcjonalnie.
• Kiedy szalki Petriego zostały odsłonięte lub zaszczepione, uczniowie nie powinni ich ponownie otwierać.

Inkubacja(7)

Umieść każdą płytkę Petriego wewnątrz torby z zamkiem błyskawicznym, aby zapobiec wysychaniu i kontrolować zapachy. Odwróć płytki do góry nogami i umieść je w ciepłym miejscu. Dla wielu mikroorganizmów, idealna temperatura inkubacji to 32°C lub 90°F. Wzrost bakterii powinien stać się widoczny w ciągu 2-3 dni.

Dla osób hodujących bakterie w domu (na przykład, badających wzrost bakterii w różnych miejscach w domu), można użyć domowej roboty „inkubatora żarówkowego” zamiast inkubatora laboratoryjnego. Ta strona opisuje jak zbudować „inkubator żarówkowy:” http://www.umsl.edu/~microbes/pdf/Incubator.pdf

Usuwanie(8)

Po zaklejeniu płytek Petriego taśmą, nie należy ich ponownie otwierać. Wszystkie mikroorganizmy wyhodowane podczas eksperymentu powinny zostać zabite przed wyrzuceniem. Najlepszym sposobem na pozbycie się kultur bakteryjnych jest sterylizacja ciśnieniowa w stabilnej termicznie torbie na odpady biologiczne. Jeśli autoklawy lub szybkowary nie są dostępne lub nie są wystarczająco duże, aby to ułatwić, alternatywą jest wybielenie płytek. Należy nasycić płytki 20% roztworem wybielacza domowego lub roztworem „1 na 5” (innymi słowy, 1 część wybielacza i 4 części wody). Pozostawić je na noc w roztworze wybielacza, a następnie wyrzucić. Należy pamiętać, że roztwór wybielacza jest żrący i należy go potem dokładnie usunąć. Ponadto, płyty można spalić, jeśli jest dostęp do spalarni.

Dorland, W.A.M. (2012). Dorland’s Medical Dictionary. Retrieved January 17, 2013 from http://www.dorlands.com/wsearch.jsp

University of Texas Health Science Center at Houston: http://med.uth.tmc.edu/

Przypisy końcowe

(1) „Agar plate.” Wikipedia. http://en.wikipedia.org/wiki/Agar_plate, dostęp 14 stycznia 2005.

(2) „Microbiology.” MadSci Network. http://www.madsci.org/posts/archives/mar98/888937612.Mi.r.html, dostęp 25 stycznia 2005.

(3) „Agary.” Difco & BBL Manual. Retrieved January 17, 2013 from http://www.bd.com/ds/technicalCenter/documents.asp

(4) To jest numer katalogowy dla agaru odżywczego. Proszę kierować się opisem pozycji na dole, obok numeru katalogowego, a nie podpisem pod zdjęciem, który mówi o agarze nie będącym pożywką.

(5) „Butelki z agarem – przygotowanie & Zastosowanie sprzętu.” Science Stuff, Inc. http://www.sciencestuff.com/playground/agar_bottle.shtml, dostęp 14 stycznia 2005 r.

(6) Mott, et al. „Artificial Environments for Growing Bacteria.” WW Bio Institute. http://www.woodrow.org, (www.woodrow.org/teachers/esi/2002/Biology/Projects/lab_skills/ls5/), dostęp 14 stycznia 2005 r.

(7) „Butelki z agarem – przygotowanie & Użycie sprzętu.” Science Stuff, Inc. http://www.sciencestuff.com/playground/agar_bottle.shtml, dostęp 14 stycznia 2005 r.