Primer (Molekularbiologie)
Synthetische Primer sind chemisch synthetisierte Oligonukleotide, in der Regel aus DNA, die so angepasst werden können, dass sie an eine bestimmte Stelle der Template-DNA anlagern. In Lösung hybridisiert der Primer spontan mit der Vorlage durch Watson-Crick-Basenpaarung, bevor er von der DNA-Polymerase verlängert wird. Die Möglichkeit, synthetische Primer zu erstellen und anzupassen, hat sich als unschätzbares Werkzeug erwiesen, das für eine Vielzahl von molekularbiologischen Ansätzen, die die Analyse von DNA beinhalten, notwendig ist. Sowohl die Sanger-Kettenterminierungsmethode als auch die „Next-Gen“-Methode der DNA-Sequenzierung erfordern Primer, um die Reaktion zu initiieren.
PCR Primer DesignEdit
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet ein Paar kundenspezifischer Primer, um die DNA-Verlängerung an entgegengesetzten Enden der zu amplifizierenden Sequenz aufeinander zu richten. Diese Primer sind typischerweise zwischen 18 und 24 Basen lang und müssen nur für die spezifischen Upstream- und Downstream-Stellen der zu amplifizierenden Sequenz kodieren. Ein Primer, der an mehrere Regionen entlang der DNA binden kann, wird sie alle amplifizieren, wodurch der Zweck der PCR entfällt.
Beim Design eines PCR-Primerpaares müssen einige Kriterien beachtet werden. Primerpaare sollten ähnliche Schmelztemperaturen haben, da das Annealing bei der PCR für beide Stränge gleichzeitig erfolgt, und diese gemeinsame Schmelztemperatur darf weder zu hoch noch zu niedrig sein, als die Annealingtemperatur der Reaktion. Ein Primer mit einer Tm (Schmelztemperatur), die zu viel höher ist als die Annealing-Temperatur der Reaktion, kann falsch hybridisieren und an einer falschen Stelle entlang der DNA-Sequenz verlängern. Ein Primer mit einer Tm, die deutlich unter der Annealing-Temperatur liegt, kann nicht annealen und sich überhaupt nicht verlängern.
Zusätzlich müssen Primer-Sequenzen so gewählt werden, dass sie eindeutig für eine DNA-Region selektieren, um die Möglichkeit einer Hybridisierung mit einer ähnlichen Sequenz in der Nähe zu vermeiden. Eine häufig verwendete Methode zur Auswahl einer Primerstelle ist die BLAST-Suche, bei der alle möglichen Regionen, an die ein Primer binden kann, angezeigt werden. Sowohl die Nukleotidsequenz als auch der Primer selbst können mit BLAST durchsucht werden. Das kostenlose NCBI-Tool Primer-BLAST integriert Primerdesign und BLAST-Suche in einer Anwendung, ebenso wie kommerzielle Softwareprodukte wie ePrime und Beacon Designer. Computersimulationen von theoretischen PCR-Ergebnissen (Electronic PCR) können durchgeführt werden, um das Primerdesign zu unterstützen, indem Schmelz- und Annealing-Temperaturen usw. angegeben werden.
Viele Online-Tools sind für das Primerdesign frei verfügbar, einige davon konzentrieren sich auf spezifische Anwendungen der PCR. Mit den populären Tools Primer3Plus und PrimerQuest lassen sich Primer für eine Vielzahl von Spezifikationen finden. Hochgradig degenerierte Primer für eine Vielzahl von DNA-Templates können mit GeneFISHER interaktiv entworfen werden. Primer mit hoher Spezifität für eine Teilmenge von DNA-Templates bei Vorhandensein vieler ähnlicher Varianten können mit DECIPHER entworfen werden. Das Primerdesign zielt darauf ab, ein Gleichgewicht zwischen Spezifität und Effizienz der Amplifikation zu erzeugen.
Die Auswahl einer spezifischen Region der DNA für die Primerbindung erfordert einige zusätzliche Überlegungen. Regionen mit einem hohen Anteil an Mononukleotid- und Dinukleotid-Wiederholungen sollten vermieden werden, da es zu Schleifenbildung kommen kann, die zu einer Fehlhybridisierung beitragen. Primer sollten nicht leicht mit anderen Primern in der Mischung annealen; dieses Phänomen kann zur Bildung von „Primer-Dimer“-Produkten führen, die die Endlösung kontaminieren. Primer sollten auch nicht stark an sich selbst annealing, da interne Hairpins und Schleifen das Annealing mit der Template-DNA behindern könnten.
Beim Design von Primern können zusätzliche Nukleotidbasen an die hinteren Enden jedes Primers angefügt werden, was zu einer maßgeschneiderten Cap-Sequenz an jedem Ende der amplifizierten Region führt. Eine Anwendung für diese Praxis ist die Verwendung bei der TA-Klonierung, einer speziellen Subklonierungstechnik ähnlich der PCR, bei der die Effizienz durch Hinzufügen von AG-Schwänzen an den 5′- und 3′-Enden erhöht werden kann.
Degenerierte PrimerBearbeiten
Es gibt Situationen, in denen die Verwendung von degenerierten Primern erforderlich ist. Dies sind Mischungen von Primern, die ähnlich, aber nicht identisch sind. Diese können bei der Amplifikation desselben Gens aus verschiedenen Organismen praktisch sein, da die Sequenzen wahrscheinlich ähnlich, aber nicht identisch sind. Diese Technik ist nützlich, weil der genetische Code selbst degeneriert ist, was bedeutet, dass mehrere verschiedene Codons für dieselbe Aminosäure kodieren können. Dies ermöglicht es verschiedenen Organismen, eine deutlich unterschiedliche genetische Sequenz zu haben, die für ein sehr ähnliches Protein kodiert. Aus diesem Grund werden degenerierte Primer auch verwendet, wenn das Primerdesign auf der Proteinsequenz basiert, da die spezifische Sequenz der Codons nicht bekannt ist. Daher könnte die Primer-Sequenz, die der Aminosäure Isoleucin entspricht, „ATH“ lauten, wobei A für Adenin, T für Thymin und H für Adenin, Thymin oder Cytosin steht, entsprechend dem genetischen Code für jedes Codon, unter Verwendung der IUPAC-Symbole für degenerierte Basen. Degenerierte Primer hybridisieren möglicherweise nicht perfekt mit einer Zielsequenz, was die Spezifität der PCR-Amplifikation stark reduzieren kann.
Degenerierte Primer sind weit verbreitet und äußerst nützlich auf dem Gebiet der mikrobiellen Ökologie. Sie ermöglichen die Amplifikation von Genen aus bisher nicht kultivierten Mikroorganismen oder erlauben die Gewinnung von Genen aus Organismen, für die keine genomischen Informationen verfügbar sind. Normalerweise werden degenerierte Primer durch Alignment von Gensequenzen, die in GenBank gefunden wurden, entworfen. Unterschiede zwischen den Sequenzen werden durch die Verwendung von IUPAC-Degenerationen für einzelne Basen berücksichtigt. PCR-Primer werden dann als eine Mischung von Primern synthetisiert, die allen Permutationen der Codon-Sequenz entsprechen.