All About Agar
An Introduction to Agar
Com o seu odor característico, pode-se facilmente distinguir o ágar dos outros materiais normalmente encontrados num laboratório. Quimicamente, o ágar é um polímero composto por subunidades da galactose açucareira, e é um componente das paredes celulares de várias espécies de algas vermelhas que são geralmente colhidas na Ásia Oriental e Califórnia. Dissolvido em água a ferver e arrefecido, o ágar de laboratório tem um aspecto gelatinoso. Embora a principal utilização do ágar seja como meio de cultura para vários microorganismos, particularmente para bactérias, as suas outras utilizações menos conhecidas incluem servir como espessante para sopas e molhos, em geleias e gelados, em cosméticos, para clarificação de bebidas, e para o dimensionamento de tecidos.(1)
Pode-se perguntar porque é que o ágar, em oposição à gelatina regular (como a encontrada na gelatina), é utilizado para cultivar bactérias. A resposta é o ágar, ao contrário da gelatina, não será degradado (comido) pelas bactérias. Além disso, o ágar-ágar é mais firme e mais forte que a gelatina. No entanto, ainda é possível usar gelatina como meio de cultura para bactérias se o ágar não estiver disponível.(2)
O Difco & BBL Manual dá mais detalhes sobre o ágar e a sua utilização:(3)
O ágar é um fitocolóide extraído de um grupo de algas marinhas roxas vermelhas (Classe Rhodophyceae) incluindo Gelidium, Pterocladia e Gracilaria. O gelidium é a fonte preferencial de ágar-ágar. Impurezas, detritos, minerais e pigmentos são reduzidos a níveis especificados durante o fabrico.
O ágar é um gel à temperatura ambiente, permanecendo firme a uma temperatura tão elevada como 65°C. O ágar derrete a aproximadamente 85°C, uma temperatura diferente daquela a que solidifica, 32-40°C. Esta propriedade é conhecida como histerese. O ágar é geralmente resistente às forças de cisalhamento; contudo, diferentes ágares podem ter diferentes resistências de gel ou graus de rigidez.
O ágar é tipicamente utilizado numa concentração final de 1-2% para solidificar meios de cultura. Quantidades mais pequenas (0,05-0,5%) são utilizadas em meios para estudos de motilidade (0,5% p/v) e para crescimento de anaeróbios (0,1%) e microaerófilos.
Especificações para ágar de grau bacteriológico incluem boa clareza, temperatura de gelificação controlada, temperatura de fusão controlada, boas características de difusão, ausência de inibidores bacterianos tóxicos e relativa ausência de minerais e compostos metabolicamente úteis.
O Melhor Ágar para Projectos de Estudantes
Para estudantes que cultivam bactérias em casa sem a supervisão de um professor (por exemplo, investigando o crescimento de bactérias em vários locais à volta da casa), é importante usar uma formulação de ágar que não cresça preferencialmente um tipo de bactérias em vez de outro. O pior caso seria um que crescesse preferencialmente bactérias patogénicas. Por conseguinte, recomendamos um ágar de nutrientes simples. Prontos a usar, os pratos de petri com ágar nutriente podem ser comprados directamente à Carolina Biological.
Tipos comuns de ágar
Diferentes tipos de ágar são utilizados para o cultivo de diferentes estirpes de bactérias. Geralmente, um procedimento experimental dir-lhe-á qual o tipo de ágar a utilizar. Se ainda não tiver a certeza, pergunte a um professor ou consulte o nosso fórum Ask An Expert. Nem todos os tipos de ágar são bons para os estudantes usarem em casa sem supervisão. A lista seguinte dar-lhe-á uma visão geral de alguns dos tipos de ágar comummente encontrados em laboratórios. Muitos destes podem ser comprados na Carolina Biological.
| Type of Agar | Brief Description | Suitable for Student Use? | |
|---|---|---|---|
| Blood Agar | Contém células sanguíneas de um animal (por exemplo, uma ovelha); a maioria das bactérias crescerá neste meio. | Não, devido ao potencial de contaminação por contacto humano. | |
| Ágar de chocolate | Comprido de sangue de ovelha que fornece os factores X e V necessários para o crescimento de Haemophilus, este é um meio nutriente que é usado no cultivo de organismos fastidiosos como as espécies de Haemophilus e Neisseria. O ágar de chocolate, contudo, não revela dados de hemólise, pelo que a diferenciação das espécies entre os membros de Haemophilus deve ser realizada de outra forma. | Não, devido ao potencial de contaminação por contacto humano. | |
| LB (Luria Bertani) Agar | Um subtipo de ágar nutriente, este é o meio geral para estudos de microbiologia e pode ser utilizado para o cultivo de rotina de microrganismos não particularmente fastidiosos. Além disso, não cultiva preferencialmente um tipo de bactérias em vez de outro. | Yes. | |
| MacConkey Agar | Este é um ágar sobre o qual apenas bactérias Gram-negativas podem crescer. Além disso, a E.coli irá crescer em colónias vermelhas, uma vez que há um indicador de pH presente. Deve ser mencionado que o ágar MacConkey em pó vem em duas versões: uma com a lactose de açúcar, e outra sem qualquer adição de açúcares. Uma vez que a E.coli fermenta os açúcares aos ácidos (e portanto a cor vermelha), pode-se adicionar um dos muitos tipos diferentes de açúcares a este ágar MacConkey sem açúcar e ver se as colónias vermelhas se desenvolvem. Se obtiver colónias vermelhas, sabe que a estirpe de E.coli que está a utilizar pode utilizar esse açúcar. | Não, devido à selectividade. | |
| Agar LB de Miller | Esta variação comum do ágar LB parece ter os mesmos componentes que o LB, apenas em proporções diferentes. | Sim, mas é recomendável aderir à fórmula genérica. | |
| Neomycin Agar | Contém o antibiótico neomicina, que se encontra em muitos medicamentos, tais como cremes, pomadas e gotas para os olhos. A neomicina foi descoberta em 1949 pelo microbiologista Selman Waksman, e é produzida naturalmente pela bactéria Streptomyces fradiae. Além disso, a Neomicina tem um amplo espectro de efeitos, matando tanto bactérias gram-positivas como gram-negativas. É relativamente tóxica para os seres humanos, e algumas pessoas têm reacções alérgicas à mesma. Muitas vezes, o ágar Neomicina é utilizado para cultivar organismos anaerobiamente. A neomicina impede o crescimento de bacilos gram-negativos e estafilococos, permitindo que as espécies de Streptococcus cresçam mais abundantemente. | Não, devido a preocupações de segurança. | |
| Agar não-nutriente | Usualmente não adequado para o cultivo de bactérias. Contudo, pode ser utilizado para o cultivo de outros microrganismos. | No. | |
| Nutriente Ágar | Vai cultivar o maior número de diferentes tipos de microrganismos – fungos e bactérias. No entanto, nem todas as bactérias podem crescer sobre estes. Algumas acham-na demasiado rica, e outras acham-na deficiente. O nutriente nisto é caldo de carne, e alguns extractos de levedura. | Sim. | |
| Utilizado para fungos e tem um pH baixo que matará a maioria das bactérias. Contém gentamicina, que é um antibiótico aminoglicosídico. A gentamicina também pode tratar muitos tipos diferentes de infecções bacterianas, particularmente infecções Gram-negativas. | Não, devido a preocupações de segurança. | ||
| Thayer-Martin Agar | Agar de chocolate concebido para isolar a Neisseria gonorrhoeae, também conhecida como “gonococcus”, que é uma espécie de bactéria Gram-negativa responsável pela doença gonorreia. | Não, devido ao potencial de contaminação por contacto humano. | |
| Tryptic Soy Agar | Um meio básico utilizado para cultivar muitos tipos de microrganismos. O ágar de soja triptico é utilizado principalmente como meio de crescimento inicial para: observar a morfologia da colónia, desenvolver uma cultura pura, conseguir um crescimento suficiente para mais testes bioquímicos, e armazenamento de cultura. | Xylose lysine deoxicolate agar. É utilizado para a cultura de amostras de fezes, e contém dois indicadores. É formulado para inibir bactérias Gram-positivas, enquanto que o crescimento de bacilos Gram-negativos é encorajado. As colónias de fermentadores de lactose parecem amarelas. | Não, devido à selectividade. |
Preparação de ágar engarrafado e placas(5)
Pre-experimento:
Pratos de Petri estéreis fechados até estarem prontos a verter ágar neles. Os contaminantes transportados pelo ar podem facilmente invadir uma placa de Petri aberta.
Embora placas de ágar pré-lavado estejam disponíveis, pode-se fazer placas de ágar a partir de pastilhas, pó, ou ágar engarrafado, seguindo algumas instruções simples. Os kits de ágar vêm geralmente com instruções detalhadas sobre como preparar placas, e abaixo estão os procedimentos de amostra para referência. Em caso de dúvida, leia claramente as instruções e peça ajuda se necessário (consulte um professor ou ligue para a linha de ajuda técnica do fornecedor do kit de ágar).
Preparar a Tábua ou o Ágar em Pó:
A formulação para ágar LB (Luria Bertani) é: 9,1 g/L tryptone, 4,6 g/L extracto de levedura, 4,6 g/L NaCl, e 13,7 g/L ágar. Se utilizar comprimidos, dissolver 10 comprimidos por 500 ml de água. Para pós de ágar-ágar, dissolver por micro-ondulação, 6,9 g de ágar-ágar em 500 ml de água. 500 ml de ágar de ágar verterão ~ 25 grandes placas de Petri (100 mm de diâmetro) ou 50 pequenas placas de Petri (60 mm de diâmetro).
Preparação de ágar engarrafado:
- Desaperte a tampa da garrafa, mas não retire a tampa enquanto aquece.
- Aqueça a garrafa de ágar num banho de água quente ou no microondas até se tornar líquida.
- Após abrir a tampa, passar o gargalo da garrafa de ágar através de uma chama para a esterilizar. Não perder a tampa!
- Enquanto despeja o ágar, abra a tampa da placa de Petri o menos possível, segure-a num ângulo, e certifique-se de que a tampa é mantida directamente sobre a placa de Petri.
- Verter ágar fundido suficiente em cada prato de Petri de plástico estéril para cobrir 1/8″ do fundo. Cobrir imediatamente a tampa da placa de Petri.
- Colocar placas de ágar em cima de um balcão para arrefecer e colocar. O meio de ágar fixar-se-á como gelatina dura à temperatura ambiente.
- Passa novamente o gargalo da garrafa de ágar pela chama antes de aplicar a tampa.
Preparar placas pré-preparadas:
Se as placas tiverem sido refrigeradas, coloque-as para fora e deixe-as aquecer à temperatura ambiente.
Armazenamento:
Pratear as placas de ágar de cabeça para baixo no frigorífico. Não Congelar! O objectivo de colocar as placas de cabeça para baixo é evitar que a condensação escorra para a superfície do ágar, o que poderia então facilitar o movimento de organismos entre colónias.
Por favor, ver http://www.umsl.edu/~microbes/pdf/tipsforplates.pdf para dicas adicionais.
Considerações adicionais de segurança(6)
- Ao agitar a solução de caldo, deve-se tomar nota especial ao iniciar a escala de agitação a uma configuração baixa e adicionar mais velocidade a partir daí.
- Ao aquecer o caldo, certificar-se de cobrir o frasco de modo a não se prestar a ferver, mas sim a evitar derrames.
- Ao verter o caldo, certifique-se de que enche a placa de Petri sem se queimar a si próprio. Além disso, é importante neste processo certificar-se de que a placa de Petri é coberta imediatamente para permitir que a substância arrefeça proporcionalmente.
- Uma vez expostos ou inoculados os pratos de Petri, os alunos não devem reabri-los.
Incubação(7)
Colocar cada placa de Petri dentro de um saco com fecho de correr para evitar a secagem e para controlar os odores. Virar as placas de cabeça para baixo e colocá-las num local quente. Para muitos microrganismos, a temperatura ideal para incubação é de 32°C ou 90°F. O crescimento bacteriano deve começar a tornar-se visível em 2-3 dias.
Para as bactérias em crescimento em casa (por exemplo, investigar o crescimento de bactérias em vários locais à volta da casa), pode utilizar uma “incubadora de lâmpadas” caseira no lugar de uma incubadora de laboratório. Esta página descreve como construir uma “incubadora de lâmpadas eléctricas”:”. http://www.umsl.edu/~microbes/pdf/Incubator.pdf
Disposal(8)
Uma vez fechadas as placas de Petri, estas não devem ser abertas novamente. Todos os microrganismos cultivados durante a experiência devem ser mortos antes de serem descartados. A melhor maneira de eliminar as culturas bacterianas é esterilizá-las sob pressão num saco de risco biológico estável ao calor. Se autoclaves ou panelas de pressão não estiverem disponíveis ou não forem suficientemente grandes para tornar isto conveniente, uma alternativa é alvejar as placas. Saturar as placas com uma solução branqueadora doméstica de 20% ou “1 em 5” (por outras palavras, 1 parte de lixívia e 4 partes de água). Deixá-las sentar e mergulhar durante a noite na solução de lixívia antes de as deitar fora. É favor notar que a solução de lixívia é corrosiva e precisa de ser completamente removida posteriormente. Além disso, as placas podem ser incineradas se houver acesso a um incinerador.
Dorland, W.A.M. (2012). Dicionário Médico de Dorland. Recuperado a 17 de Janeiro de 2013 de http://www.dorlands.com/wsearch.jsp
University of Texas Health Science Center at Houston: http://med.uth.tmc.edu/
Endnotes
(1) “Placa de ágar”. Wikipedia. http://en.wikipedia.org/wiki/Agar_plate, acedido a 14 de Janeiro de 2005.
(2) “Microbiologia”. Rede MadSci. http://www.madsci.org/posts/archives/mar98/888937612.Mi.r.html, acedido a 25 de Janeiro de 2005.
(3) “Agars”. Difco & Manual BBL. Recuperado a 17 de Janeiro de 2013 de http://www.bd.com/ds/technicalCenter/documents.asp
(4) Este é o número de catálogo do ágar nutriente. Por favor siga a descrição do item no fundo, ao lado do número de catálogo, e não a legenda da imagem, que diz ágar não-nutriente.
(5) “Garrafas de ágar – Preparação & Utilização de equipamento”. Science Stuff, Inc. http://www.sciencestuff.com/playground/agar_bottle.shtml, acedido a 14 de Janeiro de 2005.
(6) Mott, et al. “Artificial Environments for Growing Bacteria”. WW Bio Institute. http://www.woodrow.org, (www.woodrow.org/teachers/esi/2002/Biology/Projects/lab_skills/ls5/), acedido a 14 de Janeiro de 2005.
(7) “Garrafas de Ágar – Preparação & Utilização de Equipamento”. Science Stuff, Inc. http://www.sciencestuff.com/playground/agar_bottle.shtml, acedido a 14 de Janeiro de 2005.