Avanços na Investigação sobre Anticorpo Anticardiolipina

Abstract

Anticorpo Anticardiolipina (ACA) é uma espécie de autoanticorpo e é um dos anticorpos antifosfolípidos (aPLs). Os fosfolípidos com uma carga negativa nas plaquetas e nas membranas celulares endoteliais são antigénios alvo do ACA. A ACA é comum no lúpus eritematoso sistémico e outras doenças auto-imunes e está intimamente associada a trombose, trombocitopenia, e aborto espontâneo. Em 1983, Harris estabeleceu um método para detectar a ACA, e a investigação sobre o anticorpo ganhou atenção mundial e desenvolveu-se rapidamente. Para esta revisão, pesquisámos artigos que cobrem a maioria dos estudos relacionados com a ACA nos últimos 25 anos e extraímos ideias e conclusões influentes neste campo.

1. Introdução

O primeiro anticorpo anti-fosfolípido (aPL) foi encontrado em doentes com sífilis em 1906, e os seus antigénios associados foram identificados como fosfolípidos. As aPL incluindo o anticorpo anti-cardiolipina (ACA), antiglicoproteína I (β2GPI), e o anticoagulante lúpus (LA) são um grupo heterogéneo de autoanticorpos que reagem contra fosfolípidos, complexos fosfolipídicos-proteicos, e proteínas de ligação fosfolipídica . Em 1941, o cardiofosfolípido foi isolado do coração da vaca e nomeado, que tem a maior concentração no miocárdio e no músculo esquelético dos mamíferos. Cada molécula de fosfolípidos cardíacos contém quatro ácidos gordos insaturados, que são facilmente oxidados ou polimerizados. O estudo descobriu que a ACA tinha reactividade cruzada com a maioria dos fosfolípidos carregados negativamente. O ACA pode ser combinado com fosfodiesters com carga negativa em moléculas de fosfolípidos cardíacos, e os ácidos gordos nas moléculas de fosfolípidos são componentes essenciais da sua antigenicidade.

2. Breve Introdução de Anticardiolipina Anticorpo

ACA é um grupo de anticorpos heterogéneos que são classificados em IgG, IgA, e IgM. O ACA pode ser combinado com fosfatídeo cardíaco, fosfatidil serina, ou inositol fosfatidil. O antígeno alvo do ACA é controverso. Pode ser fosfolípidos no coração; proteínas de ligação fosfolipídica no plasma, como β2GPI; ou proteínas e compostos fosfolípidos. O antigénio alvo pode também ser os fosfolípidos que são expostos pela alteração da conformação após a formação do complexo ou dos novos determinantes antigénicos em β2GPI . A ACA pode ser detectada em muitas doenças, incluindo doenças auto-imunes, abortos recorrentes, doenças cerebrovasculares, e doenças infecciosas. A relação entre a ACA e a sua manifestação clínica está dividida em duas categorias. A ACA na doença auto-imune e na síndrome antifosfolipídica (APS) está dentro da gama auto-imune, e o seu antigénio alvo é a proteína de ligação fosfolipídica, que pode causar distúrbios de coagulação; a sífilis e outras doenças infecciosas contêm ACA não imune, cujo antigénio alvo é o cardiofosfato, e não depende de proteínas plasmáticas, como β2GPI.

3. Ensaio de Detecção Laboratorial Clínica

Em 1983, Harris et al. estabeleceram pela primeira vez o teste ACA utilizando cardiolipina como antigénio, uma mistura de gelatina/phosphate-buffered saline (PBS) para diluir as amostras de soro dos doentes e IgG ou IgM anti-humano radiomarcado para detectar ACA ligada como um ensaio radioimuno. Nos anos seguintes, o método de teste evoluiu de modo a que o soro de vaca fetal ou soro bovino adulto substituísse a gelatina/PBS como diluente de amostra para fornecer o suficiente β2GPI para um teste válido, os anticorpos IgG ou IgM anti-humanos marcados com enzimas substituíram os anticorpos IgG ou IgM marcados com radioligação, e foi estabelecido o ensaio de imunoensaio enzimático ACA (ELISA). A ACA de doentes com APS requer β2GPI como co-factor para a ligação da cardiolipina . Assim, os ensaios ACA podem depender indirectamente da função e estrutura de β2GPI.

Muitos estudiosos têm trabalhado na melhoria e padronização dos métodos de detecção ELISA. Foi demonstrado que tanto as discrepâncias como a falta de acordo interlaboratorial se devem principalmente à forma como os laboratórios realizam o teste, à forma como o teste é calibrado, e à forma como os resultados são calculados. Quando os laboratórios utilizam o kit padrão ELISA e calculam de forma uniforme, a concordância entre laboratórios ganha muito mais. No 8º Simpósio Internacional de Anticorpos Antifosfolípidos, os especialistas salientaram que a utilização rotineira de um kit ELISA foi a primeira escolha para o diagnóstico de APS. Contudo, não existe uma metodologia ELISA padronizada e a variabilidade intra e interlaboratorial permanece a um nível elevado.

Recentemente, novos métodos provaram ser úteis para a detecção de ACA. Os imunoensaios em linha que empregam uma nova fase sólida hidrofóbica para a detecção de ACA parecem ser uma alternativa intrigante. O imunoensaio por quimioluminescência (CLIA) está disponível para a detecção de ACA desde 2010. Um CLIA totalmente automatizado pode utilizar partículas paramagnéticas revestidas com cardiolipina ou humano β2GPI para capturar anticorpos das amostras de soro e depois detectar a ACA. Meneghel et al. mostraram que a CLIA tinha uma sensibilidade comparativa significativamente menor para a ACA IgM, mas uma especificidade comparativa significativamente maior para a ACA IgM em relação a uma ELISA caseira. O imunoensaio enzimático de fluorescência, que mediu a fluorescência na mistura de reacção assim que a reacção foi interrompida, foi comparado com o ELISA caseiro. Mattia et al. descobriram que as sensibilidades dos dois métodos eram semelhantes, com excepção do IgM ACA . Colectivamente, devem ser desenvolvidos sistemas de ensaio ACA totalmente automatizados para padronizar os testes ACA como resultado da variação significativa intra-ensaio e intra-ensaio.

4. A Significância Clínica da Detecção Laboratorial de ACA

4.1. Doença auto-imune

4.1.1. Lúpus eritematoso sistémico

Lúpus eritematoso sistémico (LES) é uma doença inflamatória crónica, multissistémica e auto-imune que afecta principalmente as mulheres na pré-menopausa. Em 2012, o grupo Systemic Lupus International Collaborating Clinics propôs novos critérios de classificação que incluem conteúdos clínicos e serológicos para diagnosticar e classificar o LES, e o ACA é um dos seis conteúdos serológicos . Hobbs et al. conduziram um estudo de coorte retrospectivo de um único centro para avaliar características clinicopatológicas, incluindo a ACA de pacientes pediátricos com nefrite do LES recém-estabelecido. Verificaram que 90% (19/21) dos pacientes eram positivos para a ACA . Num outro estudo, incluindo 390 pacientes com LES, 47% tinham um nível elevado de ACA. Os doentes com LES tinham um tempo de tromboplastina parcial activada prolongado (APTT), trombocitopenia, e resultados positivos do teste de Coombs, mas não tinham APS. O APTT prolongado estava fortemente associado a trombose venosa ou arterial. Um estudo descobriu que a activação plaquetária não foi induzida por ACA+LA (lúpus anticoagulante)+plasma apenas, mas foi significativamente aumentada pelo plasma ACA+LA+ em combinação com adenosina difosfato (ADP) a uma baixa concentração que teve apenas um efeito modesto na activação plaquetária. Em contraste, nenhuma das amostras de plasma ACA+LA-, ACA-LA+, ou ACA-LA- foi capaz de aumentar a activação plaquetária mesmo na presença de estimulação ADP, indicando que ACA e LA podem cooperar para promover a activação plaquetária e podem estar envolvidas na patogénese da trombose arterial e trombocitopenia em doentes com LES . Alharbi et al. avaliaram as diferenças entre a síndrome de sobreposição do lúpus eritematoso sistémico da esclerose sistémica (LESS) e o LES e constataram que o nível de ACA foi aumentado em doentes com LESS. APS

APS é uma doença auto-imune que é clinicamente caracterizada por eventos tromboembólicos venosos e/ou arteriais recorrentes ou morbilidade da gravidez e está associada com aPLs . Os pacientes devem ter critérios clínicos e laboratoriais para serem diagnosticados com SAF, e o diagnóstico de SAF requer a presença de pelo menos uma das três APLs . A trombose vascular é definida como um ou mais episódios clínicos de trombose arterial, venosa ou de pequenos vasos, envolvendo qualquer órgão, e é confirmada por imagens e/ou análises histopatológicas adequadas . Os critérios de classificação clínica da morbidade da gravidez são os seguintes: (1) uma ou mais mortes inexplicáveis de um feto morfologicamente saudável na 10ª semana de gestação ou depois dela, com morfologia fetal normal; (2) um ou mais nascimentos prematuros de um neonato morfologicamente saudável na 10ª semana de gestação ou antes dela, devido a eclâmpsia ou pré-eclâmpsia grave, ou insuficiência placentária; e (3) três ou mais abortos espontâneos consecutivos inexplicáveis antes da 10ª semana de gestação, com anomalias anatómicas ou hormonais maternas, nos quais foram excluídas as anomalias cromossómicas maternas ou paternais. O esquema de classificação actualizado de Sydney recomenda (1) uma detecção de lúpus anticoagulante de acordo com directrizes publicadas pela Sociedade Internacional de Trombose e Hemostasia; (2) ACA (IgG ou IgM) que exceda 40 unidades antifosfolípidas IgG ou IgM; ou (3) anticorpos anti-β2GPI (IgG ou IgM) a níveis que excedam o percentil 99 medido por ELISA . Foi relatado que a ACA é positiva em 84-90% dos doentes com SAF e em 25% dos doentes com SAF (sem LA) . A importância dos testes de ACA no diagnóstico da SAF foi contestada em 2002; contudo, Nash et al. demonstraram que a omissão dos testes de ACA na investigação clínica da SAF poderia levar a uma falha no diagnóstico da síndrome numa grande proporção de doentes. No seu relatório, utilizando 123 pacientes com LPA persistente, mais de um quarto dos estudos da coorte de pacientes foram positivos para a ACA e negativos para a ALA e anti-β2GPI . Assim, a importância da ACA no diagnóstico da APS não pode ser ignorada.

4.1.3. Artrite Reumatóide

Artrose Reumatóide (AR) é uma doença do tecido conjuntivo que influencia os órgãos de todo o corpo. A inflamação articular é a manifestação mais proeminente, e o envolvimento da pele é frequentemente visto. Serologicamente, a artrite reumatóide pode mostrar factor reumatóide (RF) e/ou outros auto-anticorpos. Wolf et al. recolheram espécimes de 173 pacientes consecutivos com artrite reumatóide e analisaram os resultados laboratoriais e as manifestações clínicas. Níveis anormalmente elevados de IgG e/ou IgM ACA foram detectados por ELISA nos soros de 55 (32%) doentes. Verificaram também que de 36 pacientes com nódulos reumatóides, 17 tinham níveis positivos de ACA (sensibilidade 47%) indicando uma associação estatisticamente significativa. Em contraste, Bobbio-Pallavicini et al. investigaram o efeito do tratamento com infliximab a longo prazo em vários auto-anticorpos em doentes com AR. Os resultados mostraram um aumento do título de ACA sem quaisquer manifestações clínicas relacionadas . Seriolo et al. sugeriram que a associação entre a positividade da ACA e a diminuição dos níveis de proteína S livre em doentes com AR pode representar um dos factores de risco para eventos trombóticos .

4.1.4. Púrpura Trombocitopénica Imune

Púrpura Trombocitopénica Imune (ITP) é uma desordem adquirida caracterizada por trombocitopenia isolada resultante da destruição de plaquetas periféricas mediada por autoanticorpos e a ausência de qualquer causa inicial e/ou subjacente óbvia de trombocitopenia. Despujol et al. recolheram dados de 215 doentes com ITP e descobriram que 54 (25%) doentes tinham ACA, incluindo 42 (20%) que eram IgG-ACA positivos .

Trombocitopenia, como manifestação de APS primária, tem uma prevalência relatada de 20 a 46%. Embora as evidências sugiram que a ACA pode ligar membranas plaquetárias activadas e causar destruição plaquetária, a patogénese da trombocitopenia relacionada com a ACA permanece pouco clara. Carlos et al. detectaram a IgG e IgM de aPL através de ELISA em 21 doentes com ITP e 33 com APS. Os resultados mostraram que as frequências de anticorpos IgG em ITP eram ACA (47,6%) > anti-β2GPI (19%). Em APS, pelo contrário, anti-β2GPI foi o mais frequente (73%) .

4.2. Trombose

ACA é um dos indicadores de trombose. Naess et al. sugeriram que níveis elevados de ACA não eram um factor de risco para trombose venosa subsequente numa população geral através de um grande estudo de caso coorte com base na população contendo 508 casos de trombose venosa e 1464 sujeitos de controlo pareados de um total de 66 140 participantes. Níveis elevados de ACA ainda estavam associados a um risco duas vezes maior de trombose venosa na presença de doença auto-imune (principalmente lúpus eritematoso sistémico). Godoy et al. descobriram que os níveis séricos de ACA de 34 doentes que sofriam de trombose venosa profunda estavam acima do intervalo de referência normal. No entanto, em 6 pacientes com trombose recorrente, 4 testaram como positivos. Assim, os doentes com trombose venosa profunda que são positivos para ACA tinham um risco mais elevado de trombose recorrente .

ACA atrai monócitos para a parede do vaso e induz a sua aderência às células endoteliais, que é mediada por moléculas de adesão, tais como a molécula de adesão intercelular-1, a molécula de adesão vascular-1, e a E-selectina . Um estudo confirmou que a ACA derivada de ratos (NZW × BXSB), um modelo de síndrome antifosfolipídica com enfarte do miocárdio, pode reagir cruzadamente com lipoproteína oxidada de baixa densidade, que se acredita induzir a transformação de macrófagos em células de espuma e, em alguns casos, causar danos às células endoteliais. Outro estudo descobriu que a IgG ACA foi capaz de melhorar a expressão da proteína-1 quimiotáctica monocitária (MCP-1) tanto a nível da proteína como do mRNA, e a sobreexpressão da MCP-1 tem sido implicada em várias condições patológicas, incluindo aterosclerose, trombose e doença inflamatória . Alves et al. revelaram que a ACA induz a produção de óxido nítrico de forma aguda através da expressão aumentada de óxido nítrico sintase induzível tanto em modelos ex vivo como in vivo, o que pode levar à inibição do feedback do óxido nítrico derivado do endotélio e aumentar o risco de trombose . Os possíveis mecanismos de ACA causadores de trombose são os seguintes: (1) A ACA reage com os fosfolípidos de membrana das plaquetas ou células endoteliais vasculares, inibindo assim a síntese da prostaciclina nas células endoteliais vasculares (PGI2). Assim, os factores que contribuem para a trombose são aumentados . (2) Após a ACA danificar as células endoteliais vasculares, a libertação do activador do plasminogénio é reduzida, aumentando assim a tendência para a trombose . (3) A ACA-IgG também pode causar danos imunitários directos às células endoteliais, desencadeando a adesão plaquetária, a agregação, e a activação do factor XII . (4) A ACA pode inibir a regulação da trombina, reduzir a activação da proteína C, e aumentar a actividade de coagulação sanguínea in vivo, promovendo assim a trombose.

4.3. Aborto recorrente

Aborto recorrente refere-se a abortos espontâneos consecutivos em mulheres. Um estudo destinado a avaliar a prevalência de ACA elevada em mulheres com historial de pelo menos dois abortos espontâneos constatou que foram identificados níveis elevados de ACA em 55,77% dos indivíduos. Uma revisão sistemática e uma meta-análise demonstraram uma associação positiva entre anticorpos antifosfolípidos e/ou APS em doentes com abortos recorrentes. Um estudo analisou 85 doentes pré-natais com perda fetal recorrente (casos) e um número igual de doentes pré-natais sem perda fetal recorrente (controlo) compatível com a idade. A conclusão foi que a prevalência da APL entre pacientes pré-natais com aborto recorrente foi pelo menos 3 vezes maior do que a dos clientes pré-natais normais . Estudos anteriores mostraram que a tripla positividade da aPL (ACA, anti-β2GPI, e LA) está associada a complicações da gravidez em portadores de aPL . Os dados experimentais acima referidos confirmaram uma correlação positiva entre a ACA e o aborto recorrente, especialmente em relação ao aborto recorrente em fase tardia. Portanto, a ACA pode ser usada como um dos indicadores para prever o aborto em mulheres de alto risco.

O possível mecanismo da ACA que resulta em aborto recorrente inclui os seguintes aspectos: (1) A ACA interfere com a proteína V de ligação fosfolipídica dependente do cálcio, que afecta o fluxo de sangue entre as vilosidades . (2) A combinação da ACA e do fosfato endotelial vascular pode danificar o endotélio vascular e causar a formação de trombos locais, resultando num fornecimento de sangue insuficiente para a membrana e placenta decídua, lesões vasculares, embolia placentária, e enfarte. (3) A ACA reage com plaquetas ou os fosfolípidos da membrana das células endoteliais vasculares, causando a contracção dos vasos sanguíneos locais, agregação plaquetária, e uma diminuição do volume sanguíneo da placenta, resultando finalmente numa gravidez patológica. (4) O nível do complemento total sérico diminuiu nos doentes com SAF, e o complexo imunitário circulante aumentou. Há uma activação excessiva do complemento, o que leva ao aborto fetal e a um desenvolvimento embrionário limitado . (5) Além disso, a ACA pode causar vasculite placentária, o que resulta num fornecimento de oxigénio fetal e nutrição inadequada, causando sofrimento fetal e morte.

4,4. Doença Cerebrovascular

ACA está associada à doença cerebrovascular. Estudos epidemiológicos de pacientes com apoplexia cerebral aguda não hemorrágica mostraram que a ACA estava significativamente elevada em pacientes com enfarte cerebral agudo e tinha aumentado antes do seu início. A ACA pode estar envolvida no processo de enfarte cerebral. Estudos demonstraram que o nível de ACA de pacientes com enfarte cerebral multifocal é significativamente mais elevado do que o de pacientes com enfarte cerebral único. Os pacientes com enfarte cerebral positivo para ACA tinham um risco significativamente maior de um segundo enfarte cerebral. Portanto, a ACA pode fornecer um índice de referência para o tratamento clínico .

A relação entre a ACA e os factores de risco de doença cerebrovascular é geralmente considerada como se segue: (1) Idade: nos últimos anos, acredita-se que a ACA tem uma taxa positiva mais elevada em doentes jovens com enfarte cerebral . Portanto, em pessoas de meia idade e jovens, se houver apoplexia cerebral inexplicada, ataque isquémico transitório, trombose venosa profunda, etc., pode ser examinada mais detalhadamente através da análise da ACA. Um estudo de pacientes ACA-positivos com enfarte cerebral revelou que havia mais pacientes do sexo feminino do que do sexo masculino. Os pacientes positivos eram mais propensos a ter doenças cardíacas, doenças sanguíneas, e complicações neurológicas. Para além de outros factores de risco, a taxa de recidiva de pacientes do sexo feminino era mais elevada do que a dos pacientes do sexo masculino . (2) Diabetes: os pacientes com diabetes têm uma perturbação do metabolismo da glicose e dos lípidos que pode produzir um grande número de radicais livres de oxigénio, o que causa danos nas células endoteliais vasculares, de modo que a função plaquetária é hiperactiva, produzindo uma grande quantidade de ACA. A ACA, por sua vez, afecta a síntese de PGI2 pelas células endoteliais vasculares, interferindo com o elemento de ajuste do trombo, activador da enzima fibrinólise, e a actividade do sistema da proteína C e inibindo a actividade da trombina III. Além disso, a ACA também promove a activação da função plaquetária e da doença microvascular, envolvendo assim trombose no organismo. (3) Tensão arterial elevada: a própria hipertensão pode levar a lesões das células endoteliais vasculares. A ACA pode reagir com os fosfolípidos de membrana na membrana celular endotelial da parede arterial, e a lesão das células endoteliais leva à exposição dos fosfolípidos de membrana, induzindo a produção de ACA. Por outro lado, a ACA agrava os danos no endotélio, formando assim um círculo vicioso. (4) Fumar: a ACA dos fumadores é significativamente superior à dos não fumadores, e o seu mecanismo pode ser o seguinte: fumar pode causar LDL susceptível à oxidação, levando a um aumento de produtos oxidantes no corpo. Além disso, a síntese e a actividade da superóxido dismutase e da glutatião peroxidase podem ser reduzidas. Os radicais livres de oxigénio aumentam muito, causando lesões celulares endoteliais vasculares para induzir a produção de ACA . (5) Hiperlipidemia: a combinação de ACA e do produto composto de β2GPI e fosfolípidos reduzirá a remoção de triglicéridos, levando à hipertrigliceridemia . Ao mesmo tempo, devido ao aumento da gordura corporal, o organismo produzirá um grande número de radicais livres de óxido e produtos de oxidação e promoverá também a formação de trombos murais, causando assim a ocorrência de acidentes cerebrovasculares e enfarte cerebral.

4,5. Doenças Infecciosas e Outros Sintomas

Desde que a associação entre a PL e a sífilis foi descrita pela primeira vez, muitas outras infecções virais, bacterianas e parasitárias mostraram induzir anticorpos anti-fosfolípidos, nomeadamente a ACA. Uma revisão da literatura mostra que embora a ACA ocorra frequentemente em infecções virais, particularmente no VIH (49,75%), HBV (24%), e HCV (20%), não está correlacionada com o risco de trombose ou manifestações hematológicas. Relativamente às infecções bacterianas, a ACA está frequentemente presente na lepra (42,7%) .

O possível mecanismo das doenças infecciosas indutoras de ACA ainda não é muito claro, mas a mímica molecular tem sido estudada. Barton demonstrou que os dois anticorpos monoclonais humanos mais amplamente reactivos do HIV-1 envelope gp41, 2F5 e 4E10, são autoanticorpos poli-específicos reactivos com a cardiolipina fosfolipídica. O ACA pode ser induzido por mímica autoantigénica dos epitopos proximais de membrana conservados do vírus . Um estudo anterior mostrou que a reactividade cruzada imunológica entre auto-antigénios e vírus, mimetismo molecular, e imunomodulação por proteínas virais pode ser responsável tanto pela reactividade cruzada com auto-antigénios como pelas funções anormais das células T e B nas doenças auto-imunes .

Alguns artigos estudados ACA noutras doenças, incluindo epilepsia, pré-eclâmpsia, coreia, síndrome de Budd-Chiari, e pancreatite crónica (especialmente para a pancreatite auto-imune). Pode haver uma patogénese auto-imune mediada, especialmente via ACA, no início destas doenças .

5. Conclusão

Acreditamos que com os contínuos melhoramentos na medicina e o rápido desenvolvimento da ciência e tecnologia, o método de detecção da ACA será mais padronizado. Considerando que os fosfolípidos com carga negativa são os principais constituintes da membrana celular e estão amplamente distribuídos por todo o corpo, os ACA podem desempenhar um papel em algumas fases da patogénese de várias doenças. Estes complexos anticorpos/anticorpos representados pela ACA estão principalmente envolvidos em doenças sistémicas complexas envolvendo múltiplos órgãos (LES, doenças trombóticas, doenças cardiovasculares, etc.). Devido a isto, a investigação sobre o seu mecanismo molecular tem sido insuficiente. Esperamos que, através de pesquisas futuras, possamos encontrar um mensageiro (como células effector) para ligar organicamente o “eixo órgão-anticorpo” e investigar doenças relacionadas com a ACA a partir de uma nova perspectiva. Como resultado, o estudo da natureza da ACA, do seu antigénio alvo, e do método de teste laboratorial da ACA ajudará a fazer avançar a medicina de precisão moderna.

Conflitos de interesse

Os autores não relatam qualquer conflito de interesse financeiro ou comercial neste trabalho.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo “The Six Top Talent Project” da província de Jiangsu (nº WSW-004), pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 81671836), e pelo Key Laboratory for Laboratory Medicine da província de Jiangsu da China (nº ZDXKB2016005).