Glycolysis
The Embden-Meyerhof-Parnas Pathway
Glycolysis can be broadly defined as an energy-yielding pathway that results in the cleavage of a hexose (glucose) to a triose (pyruvate). Embora o termo seja frequentemente tomado como sinónimo da via Embden-Meyerhof-Parnas (EMP), existem outras vias glicolíticas, entre elas a via Entner-Doudoroff que procede através de um intermediário ácido glucónico e um conjunto complexo de rearranjos que procedem através de um intermediário pentose (Figura 1).
Figure 1. As vias glicolíticas da Escherichia coli. O caminho mais afastado para a esquerda é o caminho Emden-Meyerhof-Parnas; o mais afastado para a direita é o caminho Entner-Doudoroff. Os genes que codificam as principais enzimas dos percursos são mostrados em itálico. As setas arrojadas indicam a produção ou consumo de ligações de alta energia (sob a forma de ATP ou PEP) ou redução de potência (como NADH ou NADPH). A linha curva, a negrito perto do topo da figura representa a membrana citoplasmática; reacções acima dessa linha curva ocorrem no periplasma, aquelas abaixo dela ocorrem no citoplasma.
A via EMP está presente em organismos de cada ramo da bactéria, arquebactérias, e eukarya. Claramente, esta é uma adaptação evolutiva precoce, provavelmente presente nos antepassados de todas as formas de vida actuais. Isto sugere que a via da PEM evoluiu num mundo anaeróbico e fermentativo. Contudo, a via também funciona eficientemente como base para a respiração aeróbica da glicose. As diferenças entre a fermentação e a respiração residem em grande parte nos diferentes destinos do piruvato produzido (ver mais adiante). Para simplificar, esta discussão centra-se na via da PEM na conhecida bactéria Escherichia coli, embora as características básicas da via sejam quase universais.
Antes do início do metabolismo da glicose, esta deve ser transportada para a célula e fosforilada. Na E. coli, estes dois processos estão intimamente ligados de tal forma que a glicose é fosforilada pelo sistema fosfo-transferase (PTS) à medida que passa para a célula. Uma vez que o glucose-6-fosfato (G-6-P), como a maioria se não todos os fosfatos de açúcar, é tóxico a concentrações celulares elevadas, este processo de transporte é rigorosamente regulado. A transcrição do gene transportador específico do glucose-específico, ptsG, só é máxima quando se acumula adenosina monofosfato cíclico (cAMP) (limitação da energia de sinalização). Além disso, a tradução do RNA do mensageiro ptsG (mRNA) é inibida pelo pequeno RNA sgrS, que é produzido quando o G-6-P se acumula. Assim, a importação e concomitante fosforilação para G-6-P é reduzida sempre que a procura de mais energia é baixa ou a concentração de G-6-P é perigosamente elevada.
Na ausência de uma proteína PtsG, outros transportadores ligados ao PTS, especialmente o transportador específico do manose-específico, ManXYZ, podem também transportar e fosforilatar glicose. Contudo, os mutantes PtsG crescem mais lentamente sobre a glucose do que sobre estirpes do tipo selvagem. A glucose livre pode também acumular-se intracelular da degradação de oligossacarídeos contendo glucose-como a lactose ou maltose. A entrada de glucose intracelular na via de PEM ocorre através de uma hexoquinase codificada pelo gene glk.
Os dois passos seguintes na via de PEM preparam o G-6-P para a clivagem em dois triosfatos de fosfatos. Primeiro, uma fosfoglucose isomerase reversível (gene pgi) converte o G-6-P em fructose-6-fosfato. Um pgi mutante ainda pode crescer lentamente na glicose utilizando outras vias glicolíticas (ver mais adiante), mas a via de PEM está bloqueada num pgi mutante. O fructose-6-fosfato resultante é ainda fosforilado na posição C1 a fructose-1,6,-bisfosfato à custa do trifosfato de adenosina (ATP) por uma fosfofrutoquinase codificada por pfkA. Uma segunda isozima menor de fosfofrutoquinase codificada por pfkB permite um crescimento lento de mutantes pfkA. Um conjunto potencialmente concorrente de fosfatases que remove o fosfato C1 da função fructose-1,6,-bisfosfato durante a gluconeogénese mas que são controlados durante a glicólise por uma variedade de mecanismos de feedback para evitar ciclos fúteis.
A reacção seguinte na via é a clivagem do fructose-1,6-bisfosfato a dois triosfatos que dá o nome à via (glicólise = quebra do açúcar). Esta reacção reversível é realizada pela fructose bisfosfato aldolase (gene fbaA) e produz fosfato de dihidroxiacetona (DHAP) e fosfato de gliceraldeído (GAP) como produtos. Uma segunda, a aldolase não relacionada (gene fbaB) é feita apenas durante a gluconeogénese e, portanto, não desempenha qualquer papel na glicólise. Os dois triosfatos fosfatos são livremente interconvertíveis através da triosefosfato isomerase (gene tpi). O DHAP é um substrato chave para a biossíntese de lipídios. O GAP é um nó importante na glicólise; duas outras vias glicolíticas comuns (ver abaixo) unem-se à via EMP em GAP.
Up até este ponto, a via EMP pode ser considerada como uma via biossintética uma vez que produz três blocos de construção biossintéticos chave (G-6-P, fructose-6-fosfato, e DHAP) à custa do ATP e sem quaisquer passos oxidativos. A etapa seguinte é a fosforilação oxidativa do GAP a 1,3-difosfoglicérido, um composto de alta energia. A incorporação de fosfato inorgânico por GAP desidrogenase (gene gapA) está associada à redução de NAD+ para NADH. Em condições aeróbias, este NADH é reoxidado utilizando a cadeia respiratória para produzir ATP. Em condições anaeróbias, este NADH é reoxidado por acoplamento à redução de produtos derivados de piruvato ou outros intermediários da via EMP. A enzima fosfoglicérato quinase (gene pgk), depois fosforilatos adenosina difosfato (ADP) para ATP à custa do fosfato C1 de 1,3-difosfoglicérato. Este é o primeiro de dois níveis de fosforilatos de substrato onde o fosfato é transferido de um substrato altamente reactivo directamente para o ADP sem o envolvimento da membrana ATP synthase.
Os dois passos seguintes reorganizam o fosfato 3-fosfoglicerato resultante para o último intermediário de alta energia da via, o fosfenolepiruvato (PEP). Primeiro, o fosfato é transferido da posição C3 para a posição C2 por um mutase fosfoglicérato. Existem dois isozimas evolutivamente não relacionados, um dos quais (codificado pelo gene gpmA) requer um 2,3-bisfosfoglicerato como co-factor e o outro (gene gpmM) não. Embora E. coli, Bacillus subtilis, e algumas outras bactérias tenham ambas isozimas, muitos organismos têm apenas uma ou outra. Por exemplo, a levedura Saccharomyces cerevisiae, a bactéria Mycobacterium tuberculosis, e todos os vertebrados têm apenas a enzima dependente do co-factor, enquanto as plantas superiores, a arcaea, e a bactéria Pseudomonas syringae têm apenas a enzima independente do co-factor. Um terceiro isozyme (gene ytjC) parece existir na E. coli, embora o seu papel seja menos claro.
O 2-fosfoglicérato rearranjado é então desidratado por uma enolase (gene eno) para produzir o intermediário chave, PEP. Embora o piruvato seja geralmente considerado como o produto final do percurso da PEM, pode argumentar-se que a PEP partilha essa honra. A PEP é a fonte final de fosfato para o transporte/fosforilação da glucose mediada por PtsG que inicia o percurso. Além disso, a enzima enolase é uma parte necessária do degradado que funciona com o pequeno RNA sgrS (descrito anteriormente) para inibir a tradução do ptsG mRNA e estimular a degradação do ptsG mRNA. Isto reduz a geração da acumulação tóxica de G-6-P.
É de notar que a PEP é um ponto de ramificação tanto em condições aeróbias como anaeróbias. A carboxilação da PEP por carboxilase PEP (gene ppc) fornece oxaloacetato, que condensa com a acetil-CoA derivada do piruvato para formar citrato para correr tanto o ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) como o shunt de glioxilato aerobicamente. Durante a fermentação, este mesmo oxaloacetato é um intermediário na via redutora (regeneradora do NAD) para succinato. Além disso, o oxaloacetato derivado de PEP é utilizado (através de uma porção do ciclo TCA) para a biossíntese do ácido glutâmico mesmo em condições anaeróbias.
A última reacção é uma fosforilação a nível de substrato de ADP para ATP à custa de PEP para produzir piruvato. As duas isozimas da quinase piruvada (genes pykA e pykF) são activadas por fosfatos de açúcar e o produto do gene pykF mostra uma cooperatividade positiva em relação à PEP do substrato, tendendo novamente a evitar a acumulação deste intermediário fosforilado e impedindo assim a geração de mais G-6-P através do mecanismo de transporte de PtsG dependente da PEP.
No final da via de PEM, 1 mol de glucose é convertido em 2 mol de piruvato, que pode ser utilizado para catabolismo posterior ou para biossíntese. Também produz 2 mol de ATP e 2 mol de NADH (que devem ser reoxidados para que a via continue a funcionar). Uma vez que a via gera vários intermediários tóxicos, não é surpreendente que o fluxo através da via seja rigorosamente regulado. As enzimas da via respondem rapidamente às variações da oferta e da procura através da inibição de feedback e activação do substrato das actividades enzimáticas. Também respondem (mais lentamente) por regulação transcripcional da expressão genética em resposta a reguladores globais que variam de organismo para organismo.
A via EMP funciona para gerar tanto intermediários biossintéticos como energia catabólica a partir da glicose. Contudo, também serve como uma linha de tronco central para a qual se alimentam muitas outras vias catabólicas. G-6-P, fructose-6-fosfato, DHAP, e GAP são pontos de junção comuns onde as vias catabólicas para açúcares, álcoois, gorduras, e ácidos orgânicos se alimentam na via EMP.