Microscopia de contraste de fase

Introdução

Microscopia leve oferece uma técnica poderosa para a imagem sem rótulos de amostras biológicas, tais como células. A imagem sem rótulos está particularmente bem colocada para compreender mais sobre as células, uma vez que estão livres de quaisquer modificações que possam potencialmente alterar a estrutura, função ou comportamento.

No entanto, a microscopia de luz padrão sofre de limitações de baixo contraste, uma vez que a maioria das amostras biológicas nativas não absorve luz (sendo as células essencialmente pequenos sacos transparentes de água). Alterações no índice de refracção que dispersam a luz também podem revelar estrutura, mas as diferenças entre o índice de refracção das células, estruturas sub-celulares, e a sua matriz circundante são frequentemente baixas ou insignificantes. Isto leva aos baixos níveis de contraste inerentes às amostras transparentes, o que limita a microscopia de luz e outras técnicas sem rótulos como aplicações de investigação.

Existem vários métodos de imagem que geram contraste nestas amostras. Um desses métodos é o microscópio de contraste de fase. Esta técnica óptica converte as diferenças no comprimento da trajectória óptica ou índice de refracção da amostra em deslocamentos na fase de luz e utiliza estes deslocamentos de fase para criar contraste. Usando modificações subtis do caminho óptico regular de campo brilhante, o contraste de fase permite a visualização de detalhes tais como organelas intracelulares, nestas amostras sem características, sem etiquetas.

Este artigo irá introduzir a fase de luz e o mecanismo da microscopia de contraste de fase. A configuração do microscópio para realizar imagens de contraste de fase será discutida, bem como algumas das aplicações e vantagens e limitações associadas.

O que é fase de luz?

Ondas de luz podem ser descritas matematicamente como uma onda sinusoidal, como ilustrado na Fig.1 A amplitude da onda corresponde à sua intensidade, que é interpretada como brilho quando percebida pelo olho. O comprimento de onda da luz, e a sua frequência inversa, determina a energia e a cor. Na Fig.1, a onda vermelha é desfasada quando comparada com a onda azul.

A fase de uma onda num dado ponto no espaço ou tempo refere-se a onde ao longo da onda sinusoidal a onda se encontra nesse ponto particular, ou seja, a onda está num pico, numa calha, ou algures no meio? Por exemplo, duas gaivotas flutuando no mar podem estar em alturas diferentes – o comprimento de onda e a amplitude máxima das ondas são os mesmos em ambos os casos, mas a fase é diferente. Matematicamente, definimos fase em graus ou radianos, relativamente a algum ponto de referência ao longo da onda sinusoidal – por exemplo, poderíamos definir o pico da onda onde a gaivota é a gaivota no seu ponto mais alto como 0°. O ponto mais baixo seria então a 180° (π radianos), e o ponto de transição entre os dois seria 90° (π/2 radianos). A diferença de fase entre as ondas vermelhas e azuis na Fig.1 é de 90°.

Ondas leves podem interferir entre si se tiverem a mesma frequência e fases bem ordenadas, sendo o resultado dependente da diferença de fase entre as ondas. Por exemplo, ondas que têm a mesma frequência e estão perfeitamente fora de fase (diferença de fase de 180°) alinhariam pico a canal, levando a uma interferência destrutiva e resultando numa amplitude 0, as duas ondas cancelando-se perfeitamente uma à outra. Da mesma forma, ondas que estão perfeitamente em fase alinham o pico ao pico (diferença de fase de 0°) e assim interfeririam construtivamente, combinando as intensidades numa onda com o dobro da amplitude.

Qual é o comprimento do caminho óptico?

A luz move-se através de um vácuo à velocidade da luz (300.000 km/s). Se a luz se move através de uma substância mais densa, move-se mais lentamente, dependendo do índice de refracção (RI) do meio pelo qual a luz está a passar. Quanto mais alto o RI, mais lenta é a luz. Podemos, alternativamente, representar este atraso como se a luz tivesse de viajar mais longe à mesma velocidade. Este é o comprimento do percurso óptico (OPL), que é dado pela distância percorrida através de uma substância, multiplicada pelo seu RI.

Se duas ondas com o mesmo comprimento de onda partirem do mesmo ponto e tomarem caminhos diferentes antes de chegarem ao mesmo ponto, é provável que haja uma diferença no OPL. A menos que esta diferença seja um múltiplo preciso do comprimento de onda, haverá então uma diferença de fase entre as duas ondas. Isto significa que as diferenças de fase na luz da mesma amostra podem ser introduzidas forçando alguma da luz a viajar mais longe. Este é o conceito por detrás do contraste de fase.

Microscopia de contraste de fase

Microscopia de contraste de fase foi primeiro descrito pelo físico holandês Frits Zernike na década de 1930, pelo qual mais tarde recebeu o Prémio Nobel da Física (1953). O contraste de fases é uma técnica que explora a capacidade de algumas amostras de microscópio para alterar o OPL da luz que passa através dele, adicionando contraste através da interferência da luz de diferentes fases.

Amostras transparentes não manchadas (como as células) não absorvem a luz e são chamadas objectos de fase. Quando a luz passa através de uma área de amostra sem objecto de fase, não há alteração significativa na RI ou OPL, pelo que não ocorre difracção significativa (Fig.2). Esta luz que não é difratada é frequentemente referida como luz directa ou de ordem zero, uma vez que continua inalterada através da amostra.

Por outro lado, quando a luz passa através de uma área da amostra com um objecto de fase (tais como estruturas celulares), pequenas alterações no RI irão difundir e espalhar alguma luz e causar alterações no OPL, dependendo da espessura e RI de cada estrutura. Quanto mais espessa for a estrutura, maior será a difração da luz.

A luz difratada é uma pequena proporção da luz total que passou através da amostra. Esta luz difratada (que passou por um objecto de fase) chega ao detector fora de fase com a luz directa (que não passou por um objecto de fase). Este pequeno deslocamento de fase não é suficiente para causar interferência significativa entre a luz directa e difratada, o que, juntamente com a fraca absorção de estruturas transparentes, significa que há pouca diferença de amplitude entre áreas onde tais estruturas estão presentes e onde não estão.

microscopia de contraste de fase é um método que manipula esta propriedade dos objectos de fase para introduzir interferência adicional entre a luz directa e difratada. Esta técnica transforma as diferenças de fase em diferenças de brilho, aumentando o contraste em imagens de amostras não absorventes.

Como é implementado o contraste de fase?

Existem duas questões principais ao implementar a microscopia de contraste de fase: Como mudar a luz dispersa ou a luz directa mas não ambas, e como obter luz com fase bem ordenada para iluminar a amostra. Não existiam fontes de luz com uma fase uniforme antes da invenção do laser (anos 60).

Sabia-se que a limitação da luz através de um pequeno orifício gerava uma onda de luz em expansão com fase bem organizada, mas à custa de uma grande perda de intensidade. Esta onda circular foi facilmente convertida numa onda plana com uma lente. O contraste de fases compromete entre a intensidade da luz e a fase uniforme, utilizando um anel circular (anel) de iluminação. Este anel agiu de forma semelhante a um anel de pinholes, tendo qualquer direcção específica em torno do anel a mesma fase, mesmo que a fase variasse irregularmente em torno do anel.

Para deslocar a fase quer a luz dispersa quer a luz directa, é colocada uma óptica de deslocamento de fase (como um disco de vidro) no caminho da luz, onde esta afectaria predominantemente a luz directa. Na Fig.3, um plano de luz bem ordenado começa à esquerda. medida que a luz atinge a amostra, a fase e a direcção da difracção (linhas sólidas à direita da amostra) e a luz directa (linhas tracejadas) muda. A lente objectiva leva a luz dispersa e focaliza-a em ondas ordenadas, enquanto a luz directa é focalizada para o centro óptico, onde o material que muda de fase é colocado. Isto leva a luz dispersa e a luz directa de volta à fase, permitindo a geração de contraste através de interferência à chegada ao detector.

Um microscópio de contraste de fase com iluminação anular é representado na Fig.4. Implementado num microscópio moderno com correcção de infinito, o anel de mudança de fase está localizado no plano focal posterior objectivo. Os dois componentes necessários para converter um microscópio tradicional de campo brilhante num microscópio de contraste de fase são o diafragma anular colocado na abertura traseira do condensador, e a placa de fase interna opticamente compatível. A placa de fase é introduzida no caminho da luz no plano focal posterior, muitas vezes permanentemente gravada num dos elementos da lente interna da objectiva (tal como a lente do tubo da Fig.3). Esta placa de fase diminui a luz directa para corresponder mais de perto à intensidade da luz difratada, e assim reduzir ainda mais a contribuição da luz de fundo para a imagem.

A luz que passa através da amostra é refracta ou difracta devido a características com índices de refracção diferentes, criando novos caminhos ópticos. Quase todas estas novas trajectórias ópticas não passarão através das áreas atenuantes da placa de fase, mas sim através do centro não atenuante do anel de fase.

As frentes de onda que são difratadas em graus variáveis ao passar através do espécime sobrepõem-se às frentes de onda directas deslocadas no plano intermédio da imagem. Com o deslocamento de 90° tomado em consideração, a diferença de fase total ou é próxima de 1 para um deslocamento positivo, levando a uma interferência destrutiva, ou de 0 para um deslocamento negativo, levando a uma interferência construtiva. Pequenas alterações no RI, portanto, levam a grandes alterações na interferência.

Isto leva a que objectos com um RI superior ao seu ambiente apareçam escuros sobre um fundo brilhante, ou brilhantes sobre um fundo escuro, dependendo se a técnica é de contraste de fase positivo e negativo, respectivamente. O contraste de fase positivo é o padrão nos microscópios modernos, onde a escuridão das características do objecto aumenta com o seu índice de refracção, o que simula o efeito de absorção aos olhos de um observador.

Como a abertura numérica objectiva e a ampliação aumentam, a largura e o diâmetro da placa de fase diminuem. Inversamente, à medida que a ampliação aumenta, o tamanho do anel do condensador aumenta. Assim, a fim de obter imagens de contraste de fase de alta qualidade, deve ser utilizada a placa de fase e o par de anéis do condensador correctos e o anel do condensador deve ser devidamente centrado de modo a que a imagem do anel corresponda exactamente com a posição do anel de fase. Exemplos destes anéis de fase e da imagem resultante, quando comparados com técnicas não-fásicas como o campo brilhante, podem ser vistos na Fig.5.

Vantagens e Desvantagens do phase-contraste

Vantagens

A maior vantagem do contraste de fase é a sua capacidade de gerar contraste de imagem a partir de materiais que não absorvem luz, incluindo células e tecidos em cultura. Amostras finas, transparentes e sem cor podem conter detalhes tão finos que, mesmo que absorventes, não aparecem bem, como Cilia e flagella. Mas estas mesmas amostras exibem um forte contraste quando se utiliza o contraste de fase. A utilização do contraste de fase, portanto, permite identificar estruturas celulares e componentes sub-celulares tais como o núcleo e organelas (mitocôndrias, Golgi, grânulos) com densidades diferentes. A capacidade de imaginar estas amostras com elevado contraste e resolução, sem a necessidade de etiquetas, é uma propriedade altamente vantajosa do microscópio de contraste de fase.

Outra vantagem do contraste de fase é o potencial de combinação com outras técnicas, tais como o microscópio de fluorescência para identificar componentes subcelulares através de etiquetagem específica. A combinação de múltiplas metodologias proporciona oportunidades de compreender maiores níveis de detalhe a partir de uma única amostra, e proporciona novas oportunidades de obter informação adicional relacionada com a estrutura e função subcelular.

algumas amostras darão origem a um contraste mais forte quando se utilizam métodos de contraste de fase positivos ou negativos. Como exemplo, os glóbulos vermelhos humanos carecem de contraste em contraste de fase positiva, mas têm um contraste elevado quando se utilizam imagens de fase negativa. Pelo contrário, as células cancerígenas visualizadas com imagens de fase negativa exibem pouco contraste, mas quando visualizadas com contraste de fase positiva, o contorno celular, bem como os componentes internos, tais como organelas, exibem forte contraste contra a matriz circundante. A compreensão do modo mais apropriado para uma amostra específica depende provavelmente da matriz (meios de imagem, meios de crescimento), da própria amostra e das suas diferenças RI.

Desvantagens

Uma limitação do contraste de fase é que não funciona bem com amostras espessas porque as mudanças de fase de áreas abaixo ou acima do plano focal contribuem para a imagem dando origem a desfocagem desfocada. Também são comuns artefactos de fase óptica, tais como halos e padrões de contraste sombreados que podem estar presentes nas imagens.

O efeito halo é descrito pelo aparecimento de uma borda brilhante para contraste de fase positiva ou uma borda escura para contraste de fase negativa em torno de objectos grandes que obscurecem os detalhes. Os halos formam-se porque pequenas quantidades de luz difratada difratada do espécime também podem atravessar o anel de fase. Isto não está sujeito à mesma interferência no plano da imagem, o que leva a uma reversão em contraste e ao aparecimento de halos nos limites de objectos de grandes dimensões. As auréolas serão brilhantes em contraste de fase positiva, e escuras em contraste de fase negativa.

Shade-off é outra questão presente nas imagens em fase. Shade-off refere-se ao gradiente de intensidade presente nos objectos de grande fase, que podem ser os mais brilhantes no meio, assemelhando-se à intensidade da matriz circundante. Isto irá gradualmente reduzir-se em direcção aos bordos do objecto. O inverso é verdadeiro na sombra de contraste de fase negativa, onde a área central é escura, semelhante ao fundo. Isto é causado pela complicada relação entre o comprimento e a intensidade, que não é linear.

Outra questão com contraste de fase é a inversão do contraste. Isto é provocado pela presença de objectos com RI elevado junto a objectos com RI mais baixo, que parecerão mais brilhantes em vez de mais escuros (para contraste de fase positivo). Isto leva a que os objectos com alto índice de refracção pareçam brilhantes, em vez de escuros (em contraste positivo).

A configuração também tem outras limitações, incluindo a redução na resolução do sistema óptico devido à restrição da abertura numérica pelo anel de fase. Isto pode ser restritivo se a resolução for uma parte crítica da experiência de imagem.

No entanto, as vantagens que o contraste de fase oferece para a investigação biomédica e biológica superam em muito os artefactos ou limitações da técnica, e o uso do contraste de fase revolucionou vários campos da biologia celular.

Sumário

Contraste de fase é uma técnica que pode ser implementada num microscópio tradicional de campo brilhante com a adição de dois componentes, combinando placa de fase no condensador e anel do condensador, geralmente numa lente de contraste de fase. Quando correctamente configurado, o contraste de fase oferece um excelente método de visualização de amostras transparentes que de outra forma seriam quase invisíveis nas imagens tradicionais de campo brilhante.

A imagem de fase supera as limitações inerentes à imagem de absorção na visualização de componentes subcelulares com elevado contraste sem necessidade de etiquetagem específica. O contraste de fase também pode ser utilizado para complementar a microscopia fluorescente devido à diferença nas suas configurações ópticas.

O contraste de fase tem algumas limitações, tais como artefactos de fase óptica e não-linearidade. Globalmente, a técnica tem contribuído significativamente como método de imagem óptica e continua a ser de valor crítico para uma variedade de diferentes aplicações.