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p>onde α é a proporção do genoma que não é codificador e β é a proporção de mutações em sequência de codificação de proteínas que são não-sinónimas. δx é a proporção de mutações da classe x (i é intergénica, s é sinónimo e n é não-sinónimo) que são efectivamente neutras. α e β são aproximadamente 0,15 e 0,7, respectivamente, no nosso conjunto de dados. Embora haja selecção sobre o uso de códão sinónimo em muitas bactérias, a selecção parece ser fraca, pelo que assumimos que δs = 1. Isto implica, a partir da taxa a que as mutações não-sinónimas se acumulam relativamente às mutações sinónimas, que δn = 0,6. Uma análise recente de regiões intergénicas em várias espécies de bactérias concluiu que a selecção é mais fraca em regiões intergénicas do que em sítios não-sinónimos; assumimos, portanto, que δi = 0,8 . A utilização destas estimativas sugere que a selecção nos leva a subestimar a verdadeira taxa de mutação por ano na natureza em aproximadamente 27%; isto, por sua vez, significa que sobrestimámos o DT em aproximadamente 37%, um efeito relativamente pequeno. Para investigar quão sensível esta estimativa é aos parâmetros da equação 1, variamos cada um deles por sua vez (material electrónico suplementar, tabela S4). Verificamos que a taxa de mutação observada é mais sensível à selecção sobre o uso de códão sinónimo, porque se houver selecção sobre o uso de códão sinónimo, isto também afecta as nossas estimativas de selecção em sítios não sinónimos e em sítios intergénicos. Por exemplo, se a selecção sobre o uso de códão sinónimo deprimisse a taxa de acumulação de sinónimos em 0,5, isto levaria a uma subestimação da taxa de mutação de 63%, o que, por sua vez, teria levado a uma sobreestimação de 2,7 vezes do DT.

Finalmente, embora cada estudo tenha tentado remover polimorfismos de nucleótidos únicos (SNPs) que tinham surgido por recombinação, é possível que alguns ainda estejam presentes nos dados. Os SNPs recombinantes podem ter dois efeitos. Primeiro, se tiverem recombinado de fora do clade, inflacionam a estimativa da taxa de acumulação e, portanto, levam a uma subestimação do DT. Segundo, se houver recombinação dentro de um clade, afectam a filogenia e potencialmente levam a que a raiz da árvore seja estimada como mais nova do que deveria ser. Isto levará a uma sobrestimação do DT.

É importante apreciar que o nosso método estima um DT médio dentro de um ambiente particular do qual as bactérias foram amostradas. A bactéria pode passar por períodos de quietude intercalados com períodos de crescimento.

Apesar das suposições que fizemos no nosso método, a nossa estimativa do DT de Pseudomonas aruginosa de 2,3 h num doente com FC é muito semelhante à estimada independentemente utilizando o conteúdo ribossómico das células entre 1,9 e 2,4 h . Há também provas independentes de que existem algumas bactérias que se dividem lentamente no seu ambiente natural. Estima-se que o simbionte pulgão Buchnera aphidicola duplica a cada 175-292 h no seu hospedeiro , e Mycobacterium leprae duplica a cada 300-600 h em patins de rato , não no seu ambiente natural, mas provavelmente semelhante à pele humana. Além disso, numa recente experiência de selecção, Avrani et al. descobriram que várias populações de E. coli, que estavam esfomeadas de recursos, acumularam mutações no gene do núcleo da RNA polimerase. Estas mutações fizeram com que estas estirpes se dividissem mais lentamente do que as não mutadas quando os recursos eram abundantes. Curiosamente, estas mesmas mutações são encontradas em alta frequência em bactérias não cultiváveis, sugerindo que existe uma classe de bactérias de crescimento lento no ambiente que são adaptadas à fome.

Korem et al. propuseram recentemente um método geral através do qual o DT pode ser potencialmente estimado. Observam que as células bacterianas replicadoras têm duas ou mais cópias do cromossoma perto da origem da replicação, mas apenas uma cópia perto do terminal, se a divisão celular ocorrer rapidamente após a conclusão da replicação do ADN. Utilizando a sequenciação da próxima geração, mostram que é possível testar este sinal e que a relação entre a profundidade da sequenciação perto da origem e do terminal está correlacionada com as taxas de crescimento bacteriano in vivo. Brown et al. estenderam o método a bactérias sem genoma de referência e/ou sem origem conhecida e términus de replicação. Em princípio, estas medidas das células que realizam a replicação de ADN poderiam ser utilizadas para estimar o DT das bactérias na natureza. Contudo, não é claro como ou se os métodos podem ser calibrados. Tanto Korem et al. (2015) como Brown et al. (2016) descobrem que as suas medidas de replicação têm uma mediana de aproximadamente 1,3 entre bactérias no intestino humano. No entanto, um valor de 1,3 traduz-se em diferentes valores relativos e absolutos do DT nos dois estudos. Brown et al. mostram que a sua medida de replicação, iRep, está altamente correlacionada com a medida de Korem et al., PTR, para dados de Lactobacillus gasseri; a equação relativa às duas estatísticas é iRep = -0,75 + 2 PTR. Assim, quando PTR = 1,3, iRep = 1,85 e quando iRep = 1,3, PTR = 1,03. Os dois métodos não são consistentes. Também produzem estimativas muito diferentes para o DT absoluto. Korem et al. mostram que o PTR está altamente correlacionado com a taxa de crescimento da E. coli cultivada num quimióstato. Se assumirmos que a relação entre o PTR e a taxa de crescimento é a mesma entre bactérias in vivo e in vitro, então isto implica que o DT mediano para o microbioma humano é aproximadamente 2,5 h. Em contraste, Brown et al. estimam que a taxa de crescimento de Klebsiella oxytoca é de 19,7 h num recém-nascido usando contagem fecal e descobrem que esta população tem um valor iRep de aproximadamente 1,77. Este valor é maior que a grande maioria das bactérias no microbioma humano e bactérias na Candidate Phyla Radiation, sugerindo que a maioria das bactérias nestas duas comunidades se replicam muito lentamente. Estas discrepâncias entre os dois métodos sugerem que pode não ser fácil calibrar os métodos PTR e iRep para produzir estimativas do DT através das bactérias.

Finalmente, como devemos interpretar os nossos resultados para as cinco espécies focais no contexto do que é conhecido da sua ecologia? Vibrio cholerae apresenta o DT mais curto de 1,1 h. As espécies Vibrio são omnipresentes em ambientes estuarinos e marinhos . São conhecidas por terem tempos de geração muito curtos em cultura, sendo o mais curto Vibrio natriegens de apenas 9,8 min . Na natureza, podem explorar uma vasta gama de fontes de carbono e energia, e como tal têm sido designadas como “oportunitrofas” . As comunidades Vibrio naturais não crescem continuamente a um ritmo acelerado, mas podem existir por longos períodos num estado semi-dormente pontuado por impulsos rápidos de elevadas taxas de crescimento, ou floresce, quando as condições são favoráveis. Também tem sido argumentado que a divisão invulgar dos genomas de Vibrio em dois cromossomas facilita um crescimento mais rápido . Ao apontar para um DT muito curto em V. cholerae, a nossa análise é, portanto, consistente com o que é conhecido da ecologia desta espécie.

Staphylococcus aureus é predominantemente encontrado em animais e humanos e habita várias partes do corpo, incluindo a pele e o tracto respiratório superior . Pode causar infecção da pele e dos tecidos moles, bem como bacteriemia . O Staphylococcus aureus apresenta uma gama de modos de crescimento, alguns dos quais podem permitir-lhe sobreviver ao stress e aos antimicrobianos enquanto está no seu hospedeiro. Por exemplo, pequenas subpopulações podem adoptar um estilo de vida de crescimento lento e quase dormente, quer num biofilme multicelular ou como pequenas variantes de colónia (SCVs) ou células persistentes . O nosso curto DT de 1,8 h sugere que este não é o estado típico para S. aureus na natureza, o que não é surpreendente considerando que a incidência de SCVs em amostras clínicas é bastante baixa, entre 1 e 30% .

Pseudomonas aeruginosa pode habitar uma grande variedade de ambientes, incluindo solo, água, plantas e animais. Tal como as nossas outras espécies focais, é um agente patogénico oportunista e pode também infectar seres humanos, especialmente aqueles com sistemas imunitários comprometidos, tais como os doentes com FC. Neste contexto, a infecção é crónica. A evolução paralela, a regulação diferencial dos genes que lhe permitem escapar ao sistema imunitário hospedeiro e resistir ao tratamento antibiótico durante a infecção, e as provas de selecção positiva sugerem que a P. aeruginosa pode adaptar-se aos pulmões dos indivíduos com FC para a sua sobrevivência a longo prazo. Sabe-se que cresce activamente na expectoração , onde utiliza a nutrição disponível que apoia o seu crescimento a densidades populacionais elevadas . A sua capacidade de se adaptar e crescer activamente na expectoração CF é consistente com o seu DT relativamente curto de 2,3 h, especialmente considerando que este é o ambiente em que a taxa de acumulação foi medida e corresponde à estimada por Yang et al. .

Escherichia coli e S. enterica residem principalmente no intestino inferior de humanos e animais, mas também podem sobreviver no ambiente. Embora a E. coli seja normalmente recuperada de amostras ambientais, não se pensa que seja capaz de crescer ou sobreviver por períodos prolongados fora das entranhas de animais de sangue quente, excepto em regiões tropicais onde as condições são mais favoráveis, embora algumas estirpes filogenéticas distintas pareçam reproduzir-se e sobreviver bem no ambiente . Em contraste, a Salmonella é também um colonizador entérico de animais de sangue frio, em particular répteis, está melhor adaptada do que a E. coli para sobreviver e crescer em nichos ambientais. Por exemplo, a Salmonella pode sobreviver e crescer durante pelo menos um ano no solo , enquanto a E. coli pode sobreviver apenas durante alguns dias . Embora estes nichos secundários possam desempenhar um papel mais importante na Salmonella do que na E. coli, as taxas de crescimento no ambiente continuarão a ser muito mais baixas do que as de um intestino. Portanto, a maior tenacidade da Salmonella em ambientes não hostis em comparação com a E. coli poderá ajudar a explicar o DT mais lento nesta espécie.

Em resumo, a disponibilidade de estimativas da taxa de acumulação e mutação permite-nos inferir o DT para bactérias na natureza, e a distribuição de DTs selvagens entre espécies bacterianas. É provável que estas estimativas de DT sejam subestimadas porque se espera que a taxa de mutação por geração seja maior na natureza do que no laboratório, e algumas mutações não são geradas pela replicação do ADN. A nossa análise, portanto, sugere que os DT no estado selvagem são tipicamente mais longos do que os do laboratório, que variam consideravelmente entre espécies bacterianas e que uma proporção substancial de espécies tem DT muito longos no estado selvagem.