Primer (biologia molecular)
primas sintéticos são oligonucleótidos sintetizados quimicamente, geralmente de ADN, que podem ser personalizados para recozer a um local específico no ADN modelo. Em solução, o primer hibridiza espontaneamente com o modelo através do emparelhamento da base Watson-Crick antes de ser estendido pela DNA polimerase. A capacidade de criar e personalizar primers sintéticos provou ser uma ferramenta inestimável necessária para uma variedade de abordagens biológicas moleculares envolvendo a análise do ADN. Tanto o método de terminação em cadeia Sanger como o método de sequenciação de ADN “Next-Gen” requerem iniciadores para iniciar a reacção.
desenho de iniciadores PCREdit
A reacção em cadeia da polimerase (PCR) utiliza um par de iniciadores personalizados para direccionar o alongamento do ADN em direcção a each-outros em extremidades opostas da sequência a ser amplificada. Estes iniciadores têm normalmente entre 18 e 24 bases de comprimento, e devem codificar apenas os locais específicos a montante e a jusante da sequência que está a ser amplificada. Um iniciador que pode ligar-se a múltiplas regiões ao longo do ADN amplificará todas elas, eliminando o objectivo da PCR.
Alguns critérios devem ser levados em consideração na concepção de um par de iniciadores de PCR. Os pares de iniciadores devem ter temperaturas de fusão semelhantes, uma vez que o recozimento durante a PCR ocorre simultaneamente para ambas as vertentes, e esta temperatura de fusão partilhada não deve ser nem demasiado superior nem demasiado inferior à temperatura de recozimento da reacção. Um primário com um Tm (temperatura de fusão) demasiado superior à temperatura de recozimento da reacção pode desvirtuar-se e estender-se a um local incorrecto ao longo da sequência de ADN. Um Tm significativamente mais baixo do que a temperatura de recozimento pode falhar a recozimento e prolongar-se de todo.
Adicionalmente, é necessário escolher sequências de primer para seleccionar exclusivamente uma região de ADN, evitando a possibilidade de hibridização para uma sequência semelhante próxima. Um método comummente utilizado para seleccionar um local de primer é a pesquisa BLAST, onde todas as regiões possíveis a que um primer pode ligar-se podem ser vistas. Tanto a sequência de nucleótidos como o próprio iniciador podem ser pesquisados em BLAST. A ferramenta gratuita NCBI Primer-BLAST integra o desenho do primer e a pesquisa BLAST numa única aplicação, tal como os produtos de software comercial como o ePrime e o Beacon Designer. Podem ser realizadas simulações por computador dos resultados teóricos da PCR (Electronic PCR) para ajudar na concepção de primários, dando temperaturas de fusão e recozimento, etc.
Muitas ferramentas online estão disponíveis gratuitamente para a concepção de primários, algumas das quais se concentram em aplicações específicas de PCR. As ferramentas populares Primer3Plus e PrimerQuest podem ser utilizadas para encontrar primários que correspondam a uma grande variedade de especificações. Os primários altamente degenerados para visar uma grande variedade de modelos de ADN podem ser concebidos interactivamente utilizando o GeneFISHER. Os primários com elevada especificidade para um subconjunto de modelos de ADN na presença de muitas variantes semelhantes podem ser concebidos utilizando DECIPHER. A concepção do primer visa gerar um equilíbrio entre especificidade e eficiência da amplificação.
Seleccionar uma região específica de ADN para a ligação do primer requer algumas considerações adicionais. Regiões com elevado teor de mononucleótidos e dinucleótidos devem ser evitadas, uma vez que a formação de laço pode ocorrer e contribuir para a desbridação. Os primários não devem ser facilmente recozidos com outros primários da mistura; este fenómeno pode levar à produção de produtos “primer dimer” contaminando a solução final. Os primários também não devem recozer-se fortemente a si próprios, uma vez que os ganchos e laços internos do cabelo podem dificultar o recozimento com o ADN modelo.
Ao conceber os primários, podem ser adicionadas bases nucleotídicas adicionais às extremidades posteriores de cada primário, resultando numa sequência de tampas personalizadas em cada extremidade da região amplificada. Uma aplicação para esta prática é para uso em TA clonagem, uma técnica especial de subclonagem semelhante à PCR, onde a eficiência pode ser aumentada adicionando caudas de AG ao 5′ e às extremidades 3′.
Primers degeneradosEditar
Algumas situações podem exigir a utilização de iniciadores degenerados. Estas são misturas de primários que são semelhantes, mas não idênticos. Estes podem ser convenientes ao amplificar o mesmo gene de organismos diferentes, pois as sequências são provavelmente semelhantes, mas não idênticas. Esta técnica é útil porque o próprio código genético é degenerado, o que significa que vários códons diferentes podem codificar para o mesmo aminoácido. Isto permite que organismos diferentes tenham uma sequência genética significativamente diferente que codifica uma proteína altamente semelhante. Por esta razão, os primários degenerados são também utilizados quando o desenho do primário se baseia na sequência proteica, uma vez que a sequência específica dos códões não é conhecida. Portanto, a sequência de iniciadores correspondente ao aminoácido isoleucina pode ser “ATH”, onde A significa adenina, T significa timina, e H significa adenina, timina, ou citosina, de acordo com o código genético de cada códão, utilizando os símbolos da IUPAC para bases degeneradas. Os primários degenerados podem não hibridizar perfeitamente com uma sequência alvo, o que pode reduzir grandemente a especificidade da amplificação PCR.
primidos degenerados são amplamente utilizados e extremamente úteis no campo da ecologia microbiana. Permitem a amplificação de genes de microrganismos até agora não cultivados ou permitem a recuperação de genes de organismos onde a informação genómica não está disponível. Normalmente, os primários degenerados são concebidos através do alinhamento da sequência genética encontrada no GenBank. As diferenças entre sequências são contabilizadas através da utilização de degenerações da IUPAC para bases individuais. Os iniciadores PCR são então sintetizados como uma mistura de iniciadores correspondentes a todas as permutações da sequência do códão.