Vogel-Sichtmodelle und Feldexperimente bestimmen den Überlebenswert der Pfeffermotten-Tarnung

Museums-Sammlungsfotografie

Für die digitale Bildanalyse wurden Fotografien von Pfeffermotten (Biston betularia) benötigt. Die fotografischen Daten wurden von drei Museen in Südengland bezogen: Bristol Museum and Art Gallery, der Exeter Ark of the Royal Albert Memorial Museum and Art Gallery und dem Oxford University Museum of Natural History. Die Sammlungen in Oxford sind bemerkenswert, da sie die Exemplare enthalten, die Kettlewell für seine ursprünglichen Experimente zur Vogelprädation und -zucht gesammelt hat. Für die Auswahl der intaktesten Typica- und Carbonaria-Formen beider Geschlechter für die Probenahme wurde der Zugang zu den Exemplarschubladen gewährt, wobei die Auswahl auf der Vollständigkeit der Flügel basierte. Aufgrund des Alters und der Zerbrechlichkeit dieser Exemplare war Sorgfalt im Umgang mit den gefangenen Insekten oberstes Gebot.

Wir verwendeten eine Nikon D7000 DSLR-Kamera, die zuvor einen Quarz-Umbau (Advanced Camera Services Limited, Norfolk, UK) erfahren hatte, indem der interne UV-Filter durch eine transparente Quarzplatte ersetzt wurde, wie in früheren Studien22,48. Dies ermöglichte die volle spektrale Empfindlichkeit über das gesamte sichtbare Spektrum der Vögel. Ein CoastalOpt 105 mm UV-Makro-APO-Wechselobjektiv wurde angebracht, wobei Aufnahmen im für den Menschen sichtbaren Spektrum mit einem Baader UV-IR-Sperrfilter (400-700 nm durchlässig) und Aufnahmen im ultravioletten (UV) Bereich mit einem Baader UV-Passfilter (315-400 nm durchlässig)23 gemacht wurden. Alle Bilder wurden im RAW-Format aufgenommen. Es wurde ein Bereich innerhalb der Sammlungen ausgewählt, in dem nur wenig natürliches und künstliches Licht vorhanden war, um die Beleuchtungsausrüstung nicht zu stören. Diese bestand aus einer Iwasaki EYE-Farbbogenlampe, die an ein Ventronic-Vorschaltgerät angeschlossen und auf einem PhotxPro-Fotostativ mit einem angebrachten Elinchrom-Schirm montiert war. Die Bogenlampe wurde 15 Minuten lang aufgewärmt, damit der Kolben mindestens 90 % seiner vollen Lichtleistung erreichen konnte. Vor der Verwendung wurde der UV-Sperrfilter, der über der Bogenlampe angebracht war, mit einer Stahlbürste entfernt, um ein volles Spektrum an Wellenlängen zu ermöglichen. Um das Licht gleichmäßig zu streuen, wurde eine zylindrische PTFE-Folie um die Lampe bzw. um die zu fotografierende(n) Probe(n) gelegt, falls diese zugänglich war.

Wenn es angebracht war, wurde eine Motte aus der Probenschublade entnommen und auf einen neutralgrauen Schaumstoffhintergrund gepinnt. Es wurden maximal drei Exemplare pro Aufnahme fotografiert, um sicherzustellen, dass sie alle einheitlich groß waren und die Flügel nicht aus dem Rahmen fielen. Um jeglichen Einfluss von Beleuchtungsschwankungen auszuschließen, wurde ein heller (95 %) und dunkler (5 %) Reflexionsstandard (Labsphere, Congleton, UK) zusammen mit einem Skalenbalken auf der Seite, die den Exemplaren am nächsten ist, verwendet. Die Kamera wurde mit Hilfe eines Kopierständers oder eines Stativs mit flexiblem Kopf direkt darüber positioniert und anschließend fokussiert, um eine optimale Schärfe zu erhalten. Die Belichtungszeit wurde in Abhängigkeit davon gewählt, ob mit dem sichtbaren oder dem UV-Filter fotografiert wurde und wurde für eine korrekte Belichtung und zur Vermeidung von Sättigung optimiert49. Eine Kameraverschluss-Fernbedienung wurde verwendet, um unnötiges Rauschen oder Bewegungen zu minimieren.

Natürliche Ruhehintergrund-Tarnungsanalyse

Die Tarnung zwischen dem Birkenspanner und seinen natürlichen Ruhehintergründen wurde durch Modellierung des vogelkundlichen Sehens untersucht, um chromatische und achromatische Kontraste zu vergleichen. Wälder in wenig verschmutzten Gebieten wurden besucht, um in situ Fotos von glatter Baumrinde und Fotos von Rinde mit Krustenflechten zu erhalten. Eichen (Quercus robar) und Eschen (Fraxinus excelsior) wurden aufgrund ihrer Eignung als natürlicher Ruhehintergrund ausgewählt, wie sie in früheren Experimenten mit dem Birkenspanner ermittelt wurden21,28. Die Auswahl von Krustenflechtenarten, Lecidella elaeochroma und Graphis scripta, im Gegensatz zu Blattflechten basierte auf früheren Arbeiten4,21,45 und darauf, dass frühere Experimente zeigen, dass sich Krustenflechten am häufigsten auf Baumstämmen und den Unterseiten der Hauptäste befinden28, was die natürlichen Ruheplätze sind, die vom Pfefferspinner am häufigsten aufgesucht werden11. Gegen die Verwendung von Blattflechten spricht, dass sie auf oberen Ästen vorkommen, während Krustenflechten an unbelasteten Standorten unterhalb von Ästen gedeihen4. 130 Einzelbäume wurden entsprechend der zuvor skizzierten Eignung ausgewählt, wobei 65 Exemplare mit glatter Rinde und 65 Exemplare mit flechtenbedeckter Rinde unter neutralem Licht bei Tageslicht fotografiert wurden, wobei dieselbe Nikon D7000-Kamera und dieselben Objektive verwendet wurden wie bei der Sammlung von Museumsexemplaren. Ein heller und dunkler Reflexionsstandard und ein Maßstabsbalken wurden in jedem Foto positioniert, um Skalierungs- und Beleuchtungsunterschiede zu korrigieren, die bei der Bildanalyse auftreten.

Um die Bilder für die Analyse vorzubereiten, wurde jedes Foto mit der frei zugänglichen Software ImageJ50 mit dem Plugin Image Calibration and Analysis Toolbox23 in ein multispektrales Bild konvertiert. Für jede Probe wurde ein RAW-Bild sowohl im UV als auch im sichtbaren Bereich ausgewählt und zuvor auf Überbelichtung geprüft. Die hellen und dunklen Reflexionsstandards wurden einzeln ausgewählt, um die Kanäle zu normalisieren und mögliche Schwankungen der Lichtverhältnisse zu berücksichtigen49. Anschließend wurde eine manuelle Ausrichtung der sichtbaren RGB- und UV-Kanäle des multispektralen 32-Bit-Bildstapels für genaue Farbmessungen durchgeführt. Für jede Probe der beiden verschiedenen Hintergrundtypen wurde eine einzelne Typica- oder Carbonaria-Mottenmorphe einmal durch zufällige Auswahl verglichen, um zu bestimmen, wie Farbe und Luminanz (Helligkeit) zwischen der Motte und ihrem Hintergrund kontrastieren.

Für die Modellierung des Sehvermögens von Raubvögeln wurde die Blaumeise (Cyanistes caeruleus) ausgewählt, da frühere Studien gezeigt haben, dass sie die Pfeffermotte angreift10,11, ihr Nahrungsverhalten durch UV-Signale beeinflusst werden kann51 und ihr visuelles System im Großen und Ganzen repräsentativ für viele höhere Sperlingsvögel ist19,52. Wir verwendeten zunächst eine bewährte Methode zur Konvertierung kalibrierter Bilder von der Kamera in den Tierfarbraum (vorhergesagte Zapfenreaktionsdaten) unter Verwendung einer Polynom-Mapping-Technik23,49,53 unter D65 (Tageslicht)-Beleuchtungsbedingungen. Diese Methode ist bei der Generierung von Zapfenreaktionsdaten im Vergleich zur Modellierung mit Reflexionsspektren23,54,55 sehr genau. Obwohl wir ein anderes Bestrahlungsspektrum hätten verwenden können (z. B. einen grünen Waldschatten), hätte dies die Ergebnisse aus mehreren Gründen nicht beeinflusst. Erstens handelt es sich bei dem Waldgebiet tatsächlich nicht um kontinuierlichen Schatten, sondern um Flecken von Bäumen und Lichtungen und somit um eine Mischung aus offenem Himmel und Waldschattenbeleuchtung. Außerdem wären reale Falter und die Modelle hier tatsächlich einer Reihe von Lichtverhältnissen ausgesetzt, die mit der Tageszeit, der Tiefe der Wald-/Vegetationsdecke und dem Wetter zusammenhängen. Außerdem berücksichtigen wir, wie die meisten anderen visuellen Modellierungen auch, den Prozess der Farbkonstanz über die sogenannte von-Kries-Transformation56,57, und es hat sich gezeigt, dass die Verwendung eines anderen Bestrahlungsspektrums kaum Auswirkungen auf die vorhergesagten Zapfenfangwerte hat57,58. Um schließlich zu zeigen, dass unsere Modellierung für die Beleuchtung robust ist, haben wir die vorhergesagten Zapfenfangwerte für 16 Falter (acht Typica und acht Carbonaria) sowohl unter D65- als auch unter Waldschatten-Bestrahlungsspektren verglichen. Wie erwartet, waren die Ergebnisse unverändert, mit folgenden mittleren Zapfenfangwerten plus Standardabweichung: doppelt (Wald = 0,22 ± 0,13, D65 = 0,21 ± 0,13), langwellig (Wald = 0,27 ± 0.15, D65 = 0.27 ± 0.15), mittelwellig (forest = 0.20 ± 0.13, D65 = 0.20 ± 0.13), kurzwellig (forest = 0.14 ± 0.10, D65 = 0.14 ± 0.10), ultraviolett (forest = 0.08 ± 0.06, D65 = 0.07 ± 0.06). In allen Fällen gab es eine sehr starke und signifikante Korrelation zwischen den Zapfenfangwerten unter den beiden Lichtbedingungen (Spearman’s Rangkorrelationstests zwischen Wald und D65 für alle Rezeptoren: p < 0.0001, r > 0,988).

Die visuelle Diskriminierung (Tarnungsgrad) wurde nach dem weit verbreiteten Rezeptor-Noise-Discrimination-Modell von Vorobyev und Osorio24 bewertet. Auf der Grundlage einer kürzlich durchgeführten detaillierten Auswertung von Schätzungen des Rezeptorrauschens59 wurde für die Farbdiskriminierung ein Weber-Anteil von 0,1 gewählt, während für die Luminanz ein Weber-Anteil von 0,2 verwendet wurde und für die Farbdiskriminierung ein Verhältnis der Einzelzapfen-Photorezeptoren (UV, kurzwellig, mittelwellig, langwellig) von 1,00: 1,92: 2,68: 2,7060. Um die Diskriminierung zu quantifizieren, wurden JND-Werte sowohl für den Farb- als auch für den achromatischen Kontrast (Luminanz) berechnet. JND-Berechnungen für letztere basieren auf Doppelzapfen und stellen dar, wie unterscheidbar zwei Spektren voneinander sind, unter der Annahme, dass die visuelle Unterscheidung durch Rezeptorrauschen begrenzt ist24,61. Als Unterscheidungsschwelle für Vögel wird ein JND-Wert von 1,00 angenommen, wobei JND < 1,00 anzeigt, dass zwei Objekte selbst unter optimalen Sehbedingungen nicht unterschieden werden können, und mit steigenden Werten > 1,00 bedeutet dies zunehmenden Kontrast und größere Unterschiede in der Unterscheidbarkeit62.

Erstellung von künstlichen Motten-Zielscheiben

Künstliche Motten-Zielscheiben für die Vogel-Raubtier-Experimente folgten einer Vielzahl von früheren Experimenten, bei denen ähnliche Zielscheiben verwendet wurden, die entweder auf natürlichen Hintergründen basierten oder so gestaltet waren, dass sie reale Arten nachahmten25,26,29,63. Die Ziele wurden mit Hilfe von Multispektralbildern erstellt, die aus den Fotos der Mottenmuseums-Exemplare generiert wurden. Wie bei einer Reihe früherer Arbeiten wurden die Bilder in die vorhergesagten Photonenfänge des Sehvermögens der Blaumeise unter D65-Beleuchtungsbedingungen umgewandelt, und dann wurde die Ausgabe eines Druckers in einem iterativen Prozess25,31,33 so kalibriert, dass die Bildfarben (Pixelwerte) konvergierten, um bei der Reproduktion den echten Motten in Bezug auf das Sehvermögen der Vögel genau zu entsprechen. Die Übereinstimmung für jedes gedruckte Ziel war ein JND-Wert < 1,00, was auf eine Ununterscheidbarkeit von einer echten Motte hinweist25,63. Im Allgemeinen tendierten die meisten bisherigen Arbeiten dazu, z. B. einfach das Aussehen der Flügel des Zielobjekts an die durchschnittliche Farbe (in Photonenfängen) des Substrats (z. B. Baumrinde) anzupassen26,64). Frühere Arbeiten, bei denen künstliche Beutetiere mit Lepidopterenmodellen abgeglichen wurden, haben ebenfalls dazu tendiert, sicherzustellen, dass die Farbabgleiche auf Zielen basieren, die in den Bereich der Photonenfangwerte des realen Tiermodells fallen25. Unsere Arbeit lehnt sich am ehesten an andere neuere Arbeiten zur Färbung von Schmetterlingen63,65 an, bei denen ein visuelles Diskriminationsmodell verwendet wurde, um Übereinstimmungen mit den realen Schmetterlingen zu erzeugen, wobei Übereinstimmungen gewählt wurden, wenn die Farben innerhalb von 1-3 JNDs lagen. Unser Ansatz ist sogar noch detaillierter, da wir im Gegensatz zu früheren Studien nicht alle Targets pro Behandlung als identisch und einfach passend zu einer durchschnittlichen Modellfärbung erstellt haben, sondern wir haben individuelle Variationen einbezogen, indem wir verschiedene individuelle Targets mit 100 einzigartigen individuellen Mottenmodellen verglichen haben (siehe unten). Daher ist unsere Arbeit sowohl durch die Berücksichtigung individueller Variationen als auch durch die Festlegung strenger Kriterien robust, wobei Modelle nur dann erstellt wurden, wenn Farb- und Leuchtdichteübereinstimmungen mit den realen Exemplaren innerhalb von 1,00 JND lagen.

Nachdem 50 Individuen jeder der beiden Morphen (n = 100) korrekt kalibriert worden waren, wurden sie skaliert, um sicherzustellen, dass ihre Größe genau mit den realen Pfeffermotten übereinstimmte; wobei jeder Flügel im Durchschnitt eine Fläche von 221 mm2 hatte. Die Exemplare wurden mit einem HP LaserJet Enterprise 500 Colour M551 auf Whatman Filterpapier Nr. 1 12,5 cm gedruckt, das auf A4-Papier geklebt wurde. Die Verwendung von Filterpapier zum Bedrucken der Targets wurde vorgenommen, weil dieses im Gegensatz zu normalem Druckerpapier ultraviolettes Licht reflektiert und es uns ermöglichte, die UV-Reflexion typischer Motten abzubilden, obwohl Druckertinte selbst nicht UV-fähig ist63. Künstliche Flügel wurden mit Plasti-Kote Matt Clear Acryl-Sprühfarbe wasserfest gemacht, was die Transmission/Reflexion von UV-Licht ermöglichte.

Ein essbarer Körper wurde aus Schmalz hergestellt, der sich in verschiedenen früheren Experimenten als sicheres, essbares und effektives Maß für die Prädationsrate von Vögeln erwiesen hat, auch wenn er an Papierzielen angebracht war27,66. In Anlehnung an frühere Protokolle wurden Schmalz und einfaches Mehl in einem Verhältnis von 1:3 gemischt, bevor fünf Tropfen schwarzer Lebensmittelfarbe für die Carbonaria-Morphen oder eine Kombination aus etwa einem roten, einem blauen, drei gelben und einem schwarzen Tropfen für die typischen Morphen hinzugefügt wurden. Weiße Lebensmittelfarbe wurde verwendet, um den Typica-Körpern ein Muster zu verleihen. Der Teig wurde zu 12 × 5 × 2 mm großen Körpern gerollt, an den künstlichen Flügeln mit einem 20-mm-Panel-Stift befestigt, der in die Mitte des Teigkörpers gesteckt wurde, und über Nacht im Gefrierschrank zum Aushärten gelassen.

Die Herstellung der essbaren Körper für die Zieltiere war zum einen durch die verfügbaren Lebensmittelfarben und zum anderen durch das Ziel, Farbe und Helligkeit gleichzeitig zu erreichen, eingeschränkt. Wir berechneten mit Hilfe der oben genannten Methoden und visueller Modellierung die Farb- und Leuchtdichtekontraste von fünfzehn Teigkörpern jeder Morphe gegen die Motten selbst und natürliche Ruhehintergründe. Für die Leuchtdichte waren die Ergebnisse für Körper zu Motten: carbonaria (mittlerer JND plus Standardfehler: 3,838 ± 0,733) und typica (3,809 ± 0,731). Für die Farbe lauteten die Übereinstimmungen: carbonaria (16,106 ± 1,477) und typica (4,991 ± 0,641). Die Vergleiche der Körper mit den jeweiligen natürlichen Hintergründen für die Leuchtdichte waren: carbonaria (3,773 ± 0,348) und typica (1,660 ± 0,309). Für die Farbe waren die Übereinstimmungen: carbonaria (13,721 ± 1,328) und typica (2,783 ± 0,148). Daher zeigen die Ergebnisse eine relativ geringe Unterscheidbarkeit der Körper sowohl zu den Motten als auch zu den Hintergründen, mit Ausnahme von carbonaria für die Farbe. Es ist jedoch sehr unwahrscheinlich, dass dieser Unterschied unsere Überlebensergebnisse aus mehreren Gründen erklärt (siehe Diskussion).

Künstliche Prädationsexperimente

Künstliche Mottenziele, die dem visuellen System von Vögeln nachempfunden waren, wurden als Stellvertreter für Pfeffermotten verwendet, um die Überlebensrate der Morphen durch ein Feldprädationsexperiment zu bestimmen. Dieser Ansatz ist gut erprobt und lehnt sich eng an eine Reihe früherer Arbeiten an25,26,27,29,30,31,32,33,34,63,64,65. Die Datenerhebung wurde im Juni 2017 durchgeführt, um mit dem Auftauchen des Apfelwicklers zwischen Mai und August 2017 zusammenzufallen. Zehn Standorte in gemischten Laubwäldern in wenig belasteten Gebieten in Südengland wurden aufgrund der Verfügbarkeit von Krustenflechten ausgewählt. In Cornwall waren dies Argal Reservoir, Penryn (50°9′11ʺ N, 5°8′11ʺ W), Lady’s Wood, Truro (50°17′24.2ʺ N, 5°3′42.2ʺ W), St Clement Wood, Truro (50°17′29.2ʺ N, 5°3′16.1ʺ W), Kennall Vale, Ponsanooth (50°11′42.3ʺ N, 5°8′59.1ʺ W), und Devichoys Wood, Truro (50°15′17.5ʺ N, 5°3′23.6ʺ W). In Hampshire wurden Holybourne Down, Alton (51°10′46,6ʺ N, 0°56′52,3ʺ W) und Chawton Park Wood, Alton (51°7′31,1ʺ N, 1°1′52,4ʺ W) besucht. Das Experiment folgte einem randomisierten Blockdesign26 mit 500 Proben in zehn Blöcken entlang eines nicht-linearen Transekts mit einer Länge von 1-1,5 km. In jedem Block gab es 25 Wiederholungen jeder Behandlung – insgesamt 50 Ziele. Diese wurden in einer Höhe von 1,7 m an einem einzelnen, mit Flechten bewachsenen Baum in einem Abstand von mindestens 10 m zueinander aufgehängt. Wenn ein Baum in dieser Höhe keine Krustenflechte aufwies, wurde der Transekt um weitere 1 m abgegangen, bis ein geeigneter Baum gefunden wurde, und dann der nächste folgende Baum im Abstand von 10 m. Die Falter wurden wahllos aus einem Beutel ausgewählt, um eine Verzerrung der Auswahl zu vermeiden, und an Stämme und unter Äste geheftet, da sich gezeigt hat, dass diese Bereiche die von den Faltern am häufigsten aufgesuchten natürlichen Ruheplätze sind11. Die Ziele wurden in einem Winkel von 20° zur horizontalen Ebene angebracht, da dies ein natürliches Verhalten von geometrischen Motten ist41 (Abb. 3). Außerdem wurden die Ziele in der Mitte des zu untersuchenden Flechtenflecks angebracht. Obwohl bei diesem und verschiedenen früheren ähnlichen Experimenten das Risiko einer unbewussten Verzerrung bestehen kann, halten wir dies aufgrund der hier angewandten Verfahren für unwahrscheinlich. Jedes Transekt wurde in drei Zeitintervallen überprüft: 6, 24 und 48 h. In jedem Intervall wurden alle Falter besucht, um festzustellen, ob eine Prädation oder ein anderes Ergebnis stattgefunden hatte. Die Ergebnisse wurden zensiert, wobei 1 für Vogelprädation stand bzw. 0 zensiert wurde, wenn die künstliche Motte bis 48 h überlebt hatte, fehlte oder ein anderes Ereignis eingetreten war, wie z. B. Prädation durch eine Schnecke (identifiziert durch Schleimspuren26). Vogelprädation war offensichtlich, wenn die künstliche Zielscheibe Risse von >50 % des Körpers aufwies19,46 und/oder die Flügel ganz oder teilweise entfernt waren. Wie in früheren Studien64 beschrieben, ist die Aufzeichnung von Prädationsereignissen mit einer so großen Anzahl von Targets unpraktisch, und in der Tat wurden Experimente wie unseres hier schon mehrfach validiert. In anderen Studien mit künstlicher Beute wurde die Prädation von Vögeln auch aus Markierungen auf Tonkörpern abgeleitet63. Das in diesem Experiment verwendete Waldgebiet ist vergleichbar mit dem anderer Studien, die Informationen über anwesende und beobachtete Beutetiere enthielten, darunter Blaumeisen (Cyanistes caeruleus), Kohlmeisen (Parus major), Rotkehlchen (Erithacus rubecula), Buchfinken (Fringilla coelebs), Amseln (Turdus merula) und Haussperlinge (Passer domesticus)32,64. Darüber hinaus wurden in früheren Studien direkte Beobachtungen von Vögeln gemacht, die lebende und gepinnte Pfeffermotten angriffen6,11.

Statistische Analyse

Die statistische Bildanalyse wurde mit der frei zugänglichen Software R (v.3.4.0)67 durchgeführt. Ein verallgemeinertes lineares Modell wurde sowohl für die Farb- als auch für die Leuchtdichte-JNDs durchgeführt, mit dem Hintergrundtyp als Antwortvariable und Morph als erklärende Variable. Die Modellresiduen wurden auf die Annahmen der Homogenität der Varianz und einer Normalverteilung überprüft, wobei die Farb-JND-Daten sowohl für Rinde als auch für Flechten eine Log-Transformation zur Korrektur der Schiefe benötigten. Für das Feldexperiment wurde eine nichtparametrische Verteilungsanalyse (Rechtszensierung) mit der Statistiksoftware Minitab 1868 mit Kaplan-Meier-Schätzung zur Messung der Überlebenswahrscheinlichkeiten durchgeführt, zusammen mit einem Vergleich der Überlebenskurven mit dem Log-Rank-Test69,70 für den Faktor Behandlung. Es wurde eine nichtparametrische Analyse durchgeführt, da Überlebensdaten häufig nicht einer vorgegebenen Verteilung folgen. Alle Signifikanzniveaus wurden auf α = 0,05 gesetzt.

Datenverfügbarkeit

Die in dieser Arbeit berichteten Daten sind in Supplementary Data 1 verfügbar.