The Assessment of Proteus mirabilis Susceptibility to Ceftazidime and Ciprofloxacin and the Impact of these Antibiotics at the Subinhibitory Concentrations on Proteus mirabilis Biofilms
Abstract
Proteus属の桿菌は患者からよく分離され、特にカテーテルを使用する患者の尿路から多く分離される。 バイオマテリアルに関連した感染症は、バイオフィルムの殺菌抵抗性のために、治療上の重要な障害となる。 本研究の目的は、P. mirabilisの浮遊性菌体のciprofloxacinおよびceftazidimeに対する感受性、バイオフィルム形成能力、およびこれらの抗生物質のsub-MIC濃度を選択してバイオフィルム形成の異なる段階に与える影響を評価することである。 研究対象となったのは、ビドゴシュッツの第一大学病院の患者の傷口や尿路から分離されたP. mirabilis 50株。 ciprofloxacinおよびceftazidimeに対する感受性の評価は、マイクロメソッドを用いて行われた。 選択した抗生物質のsub-MIC濃度がバイオフィルムに与える影響は、TTC法を用いて測定した。 試験したP. mirabilis株のうち，ciprofloxacinには20株（40.0％），ceftazidimeには32株（64.0％）の耐性が確認された。 すべての菌株がバイオフィルムを形成していたが，24.0％が弱く，26.0％が中程度，50.0％が強く形成していた。 Ciprofloxacinとceftazidimeはバイオフィルムを根絶させることがわかった。 さらに、菌株の由来、バイオフィルムの成熟度、抗生物質への耐性の関連性が証明された
1. Introduction
P. mirabilisは、大腸菌、肺炎桿菌に次いで、尿路感染症で3番目に多く分離される病原体です。
この属の細菌は、呼吸器系、創傷、骨、関節、消化管、さらには髄膜炎や菌血症などの感染症を引き起こす可能性があります。
P. mirabilisの治療における障害は、バイオフィルムを形成する能力に関係していると考えられます。
P. mirabilisの治療の障害は、P. mirabilisがバイオフィルムを形成する能力に関係しています。バイオフィルムとは、細胞外マトリックスで覆われた特定の表面や隣接する細胞に付着した、コミュニケーションをとる微生物の形成です。 バイオフィルムは、細胞外マトリックスで覆われた、特定の表面や隣接する細胞に付着した、コミュニケーションをとる微生物の形成物である。 バイオフィルムは、17世紀にAntonie van Leeuwenhoekが光学顕微鏡を用いて歯のプレートに付着した細菌を観察したことで初めて記述された。
バイオフィルムを形成する能力は、血管や尿道のカテーテル、尿管や前立腺のステント、陰茎や睾丸のインプラント、心臓弁や気管のプロテーゼなどのバイオマテリアルの使用に関連した感染症の発生と持続を促進します。
バイオフィルムに生息する細菌は、プランクトンの形態とは異なる行動を示し、さらに表現型も変化します。 バイオフィルムを形成する細胞の抗生物質に対する感受性は、プランクトンとは異なり、治療上の主要な問題となっている。 バイオフィルムの抗生物質耐性は、粘液やグリコカリックスなど、バイオフィルムの深層部への抗生物質の分布を低下させる様々なメカニズムが共存することによって引き起こされる。 また、これらの細菌は、転写を変化させ、抗生物質耐性の原因となる遺伝子を活性化させることができる。 細胞が近接しているため、異なる種や属の間でも、遺伝情報の伝達が促進される。 このような情報は、病原性因子や抗生物質耐性のメカニズムをコードするプラスミドを介して伝達される。 さらに、バイオフィルムを形成する細胞は、クォーラム・センシング（QS）という手段でコミュニケーションをとる能力を持っている。
微生物の環境に抗生物質が存在すると、その遺伝子型や表現型も変化します。
抗生物質が微生物の環境に存在すると、その遺伝子や表現型も変化する。 この濃度の抗生物質は、致死的な効果はないが、細菌の表面の分化を引き起こし、細菌の接着、表面の疎水性、移動性などの細胞機能の変化を誘発したり、食細胞による貪食や活性酸素の生成など、宿主と細菌の間の相互作用を妨害することがある。
本研究の目的は、P. mirabilisのプランクトンのceftazidimeとciprofloxacinに対する感受性をin vitroで評価し、これらの菌株のバイオフィルム形成能力を決定し、選択した抗生物質がバイオフィルム形成の様々な段階で与える影響を評価することである。
2.材料と方法
本研究では、P. mirabilis 50株を使用した。 これらの菌株は、ビドゴシュチュの第1大学病院（SU1）のDr. Antoni Juraszの診療所で治療を受けた女性19名（38.0％）と男性31名（62.0％）の尿（25；50.0％）および創傷の綿棒（25；50.0％）から分離されたものである。 菌株の同定は、以下のいずれかの検査法で行った。 API 20E/ID32E（BioMerieux社）およびVITEK GNカード（BioMerieux社）のいずれかをメーカーの推奨に従って使用しました。
菌株は20.0%のグリセロール（POCH）を添加したブレインハートインフュージョン（BHI, Becton Dickinson）に入れ、-70℃で保存した。
2.1. プランクトンに対するMICの評価
シプロフロキサシン（Sigma Aldrich）およびセフタジジム（Sigma Aldrich）の最小発育阻止濃度（MIC）の評価は、EUCAST勧告に基づくマイクロメソッドを用いて行った。
ESBL耐性のメカニズムは、National Reference Centre for Antimicrobial Susceptibility in Polandの勧告に従い、2枚のディスクを用いたディスク拡散法で決定しました
2.2. バイオフィルム形成
P. mirabilisの試験菌株はシスチン乳糖電解質欠損培地（CLED, Becton Dickinson）上で増殖させ、基準菌株であるStaphylococcus aureus 209PおよびEscherichia coli 35218はAmerican Type Culture Collection（ATCC）から入手し、5.0%羊血寒天培地（Becton Dickinson）上で増殖させた。 菌株は37℃で18時間培養した。 次に、単一のコロニーを37℃のトリプティック・ソイ・バリオン（TSB、Bio-Rad）に接種した。 18時間後、培養物を4 000rpmで15分間遠心分離した後、上清を捨て、ペレットを3.0mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS, POCH）で洗浄した。 次に、菌体懸濁液を4 000rpmで10分間遠心分離し、ペレットを滅菌したミューラーヒントンブイヨン（MHB、Becton Dickson社製）を用いて、マクファーランド濁度0.5の懸濁液とした。 そして、すべての懸濁液の20μLを、ポリスチレン製96ウェルプレートのウェルに3回繰り返して入れた。 ウェルには180μLの滅菌済みMHB培地を入れ、10倍に希釈したものを使用した。 滅菌コントロールは、200μLのMHB培地を3回繰り返して行った。 この培養液を37℃の湿度の高い部屋で24時間培養した。 その後、溶液を除去し、ウェルを滅菌蒸留水ですすぎ、37℃で乾燥させた。 その20分後、200μLのメタノール（POCH）を各ウェルに加えた。 プレートをシェーカーに乗せ、400rpmで20分間、室温で培養した。 次に、メタノールを除去し、プレートを37℃で20分間放置して乾燥させた。 次のステップでは、200μLの0.1％クリスタルバイオレット（CV、POCH）を各ウェルに加え、400rpmのシェーカーで10分間、室温で置いた。 次に、コントロールのウェルが無色になるまで、ウェルを水で十分に洗浄してCVを除去した。 プレートを37℃で20分間放置し、水を蒸発させた。
吸光度測定は、KC4 v3.4およびKC4 Signatureプログラムを用いて、分光光度計で570nmの波長で行った。 各菌株とネガティブコントロールのバイオフィルム形成を評価するために、吸光度の算術平均と標準偏差を使用した。 吸光度の閾値（）は、バイオフィルム形成の証拠であり、ネガティブコントロールの算術平均とその標準偏差の3倍の値の合計として定義された。 算出された合計値よりも低い値は、バイオフィルムの欠如として認識された。 また、和の値が4以上の場合は、軽度のバイオフィルム、4以上の場合は中程度のバイオフィルム、4以上の場合は強いバイオフィルムと判断した（図1）。
Proteus mirabilisバイオフィルム形成強度の視覚的多様性。 Proteus mirabilisバイオフィルムに対する試験済み抗生物質の影響評価
12時間および24時間のバイオフィルムを所定の方法に従って形成した。 プランクトンを含む培地を除去した後、バイオフィルムを塗布した各ウェルに100μLの滅菌MHB培地と100μLの抗生物質を添加した。
このプレートを湿度の高い部屋に置き、37℃で培養した。
プレートを湿度の高い部屋に置き、37℃で培養した。18時間後に細胞懸濁液を除去し、バイオフィルムを滅菌蒸留水で3回洗浄した。 その後、プレートを37℃で20分間放置して乾燥させた。 次に、各ウェルに100μLの滅菌済みTSB培地と100μLの滅菌済み0.1%TTC溶液（POCH）を加えた。
このプレートを37℃で2時間インキュベートした。 その後、懸濁液を除去し、プレートを3回リンスした。 続いて、各ウェルに200μLのメタノールを加えた。 その後、プレートを400rpmで5分間、室温でシェーカーにかけた。 読み取りは、470nmの分光光度計で行いました（図2）。
選択したサブMIC濃度の抗生物質によるProteus mirabilisのバイオフィルム消失の評価
2.4. 統計解析
統計解析はSTATISTICA 10 ENG (StatSoft Inc.)を用いて行った。 分布の正規性を評価した。 バイオフィルムの形成段階、抗生物質の種類、臨床サンプルの由来、シプロフロキサシンまたはセフタジジムのサブインヒビター濃度に依存する中央値間の有意差を、Kruskal-Wallis検定に従って決定した。 詳細な比較はノンパラメトリックなBonferroniのpost hoc testを用いて行った。
3.結果
3.1. 抗生物質感受性
試験したP. mirabilis株のうち、ceftazidimeに対する耐性は32株（64.0%）、ciprofloxacinに対する耐性は20株（40.0%）であった。
調査の結果、P. mirabilis 50株のうち、ciprofloxacinまたはceftazidimeのいずれかに耐性のある株は11株、両方に耐性のある株は16株であった（表3）。 一方、ciprofloxacinに耐性のある株のうち、ceftazidimeに感受性のある株は3株、ceftazidimeに耐性のある株のうち、ciprofloxacinにも感受性のある株は3株であった。
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3.2. バイオフィルムの形成
試験したすべてのP. mirabilis株はバイオフィルムを形成した。 弱いバイオフィルムを形成したのは12株（24.0%）、中程度のバイオフィルムを形成したのは13株（26.0%）、強いバイオフィルムを形成したのは25株（50.0%）であった（図3）。 強いバイオフィルムの形成が確認されたのは、尿から分離された14株（56.0％）と、創傷部のスワブから分離された11株（44.0％）であった（図3）。
株の由来によるProteus mirabilisのバイオフィルム形成の強さの違い。
ciprofloxacinに感受性のある32株のうち、16株（50.0%）が強いバイオフィルムを形成し、ceftazidimeに感受性のある20株のうち、9株（45.0%）が強いバイオフィルムを形成することがわかった（表4）。
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| S: 感受性が高い I：中間 R：耐性がある。 |
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3． Subinhibitory Concentration of Ciprofloxacin and Ceftazidime on 12- and 24-hour Proteus mirabilis Biofilm
得られた結果から、ciprofloxacinとceftazidimeの両方がP. mirabilisバイオフィルムを根絶するという声明が出されたが、これは抗菌剤の濃度上昇に伴う吸光度中央値の減少を反映している（図4）。 また、バイオフィルムの成熟度と菌株が分離された材料の種類の影響を調べました（図4）。 実施した研究では、試験した両方の抗生物質がその影響にばらつきがあることがわかりました。
12時間および24時間のP. mirabilisバイオフィルムに対するシプロフロキサシンおよびセフタジジムの選択した阻害濃度の影響。 a, b, c,…: 異なる文字で記された要素間の統計的に有意な差(分析は図の両方の部分をカバーしている)。
高い吸光度の中央値が記載されていた(尿由来の株で0.8029と0.尿からの菌株では0.8029と0.4634、傷口からの菌株では0.6292と0.3407）、シプロフロキサシンの方がセフタジジムよりも高かった（0.4548と0.2753、0.5236と0.3703、それぞれ0.125と0.250のサブMICを用いて12時間バイオフィルムを処理した（図4）。 逆に，0.5および1.0 sub-MICsの抗生物質値を用いた場合には，結果が逆転した。
24時間バイオフィルムの場合、試験したすべてのサブインヒビター濃度において、シプロフロキサシンがセフタジダイムよりもバイオフィルムの駆除に効果的であった（図4）。 尿から分離した菌株では，吸光度の中央値は，MIC1.0および0.250で相対的に0.0269から0.1384まで変化し，創傷被覆材から分離した菌株では，ciprofloxacinのMIC1.0および0.128で0.0729から0.2206まで変化した（図4）。 ceftazidimeの場合，吸光度中央値は有意に高く，MIC値が0.250および0.128のとき，尿から分離された菌株では0.3873から0.6871，創傷被覆材由来の菌株では0.5588から1.0616と，それぞれ変化した（図4）。
バイオフィルムの成熟度や株の由来にかかわらず、CiprofloxacinではMIC 1.0、ceftazidimeではMIC 0.250に相当する濃度で最も低い吸光度中央値を示した。
0.125および0.250MICのciprofloxacin濃度の12時間バイオフィルムでは、尿から分離された菌の場合（吸光度中央値はそれぞれ0.8029および0.4634）、創傷のスワブから分離された菌の場合（吸光度中央値はそれぞれ0.6292および0.3407）よりも低い吸光度中央値が見られた（図4）。 一方、0.5と1.0では、MICの結果が逆転していた（図4）。 統計的に有意な差は認められなかった（図4）。 24時間バイオフィルムでは，濃度にかかわらず，尿から分離された菌株の方が吸光度中央値が低い値を示した。これは，形成されたバイオフィルムのシプロフロキサシンに対する感受性が，傷口のスワブから分離された菌株に比べて高いことを証明している（Figure 4）。
セフタジジムの場合、バイオフィルムの成熟度や抗生物質の濃度にかかわらず、尿から分離された菌株の方がバイオフィルムの感受性が高いことがわかった（図4）。
シプロフロキサシンを使用した場合、抗生物質の濃度やサンプルの由来にかかわらず、24時間培養のバイオフィルムは12時間培養のバイオフィルムに比べて有意に高い除菌効果を示した（図4）。 シプロフロキサシンで処理した12時間バイオフィルムの吸光度中央値は、サブMIC値とサンプル由来に応じて、0.0589～0.8029、24時間バイオフィルムでは0.0269～0.2206の間で変動した（図4）。
セフタジジムは、24時間バイオフィルムよりも12時間バイオフィルムをより効率的に除去しました。これは、24時間バイオフィルムの吸光度中央値(0.3873-1.0616)よりも「若い」バイオフィルムの吸光度中央値(0.2753-0.5236)に反映されています(図4)。
4.考察
発表された研究によると、P. mirabilis株の40.0%がシプロフロキサシンに対して耐性を示しました。 この割合は，Hernándezらがこのフルオロキノロンに対して16.2％の菌株が耐性であるとした結果と比較して高い。
金山らは，ESBL(-)のP. mirabilis 46株のうち，ciprofloxacinに耐性を示したのは23.9%であり，ESBL(+)の場合は89.3%であった。 これらの結果は，HoらがESBL(-)のP. mirabilis株のうち14.0％がciprofloxacinに耐性を示し，ESBL(+)の場合は76.9％に達するとしたデータと一致する。 また，齋藤らも同様の結果を得ている。 ESBL(-)のP. mirabilis 80株のうち、13株（16.0％）がciprofloxacinに耐性を示した。 今回の研究結果は、上述の傾向を裏付けるものであった。 ESBL(-)株とESBL(+)株のうち、ciprofloxacinに耐性を示したのはそれぞれ15.4％と81.82％であった。 これに対して，LuzzaroらはESBL(+)で56.0％，ESBL(-)で2.5％と，P. mirabilisの耐性株の割合が低かった。
今回発表された研究では、尿から分離された菌は、傷口のスワブから分離された菌よりもシプロフロキサシンに対する耐性が高いことが明らかになった。 これらの結果は、他の著者の研究結果と同等のものです。 Guggenheimらは、創傷拭い液由来の菌株の100％がciprofloxacinに感受性を示すことを証明した。 Yahらは、創傷被覆材由来のP. mirabilis株のうち、この抗生物質に耐性を示した割合は5.2％と低かった。 Galesらは，尿中から分離されたP. mirabilisの81.5％がciprofloxacinに感受性を示したとしている。 斉藤らは、80株のうち13株が上記の抗生物質に耐性を示した。 一方、Wagenlehnerらは、1994年から2000年の間に尿から分離されたProteus spp.の0～11.6％がciprofloxacinに耐性を示したとしている。
今回の研究結果から、尿から分離された菌は、創傷スワブ由来の菌に比べてceftazidimeに対する耐性が高いことが証明された。 尿から分離されたP. mirabilis 74株のうち97.3％がceftazidimeに感受性を示し、2000年には同一感染源から分離された27株すべてがceftazidimeに感受性を示したというGalesらの結果と一致した。 Lautenbachらの結果も同様で、尿から分離されたP. mirabilis株の91～100％がセフタジジムに感受性と判定された。 Wagenlehnerらは、尿中から分離されたProteus spp.の0～4.5％がセフタジジムに耐性であることを証明した。 Lockhartらも同様の結果を得ており、それによると尿から分離された菌株の5.2％が耐性であった。 また、AnguzuとOlilaは、傷口のスワブから分離されたP. mirabilisのうち、セフタジジムに感受性のある株が87.5％と高い割合であったと報告しています。
今回の研究では、ceftazidimeとciprofloxacin sub-MICが、0.125 MIC、0.25 MIC、0.5 MIC、1 MICの4種類の抗生物質濃度で、P. mirabilisが形成した12時間および24時間のバイオフィルムに影響を与えることもわかりました。
Nucleoらは、ESBL(+)株はESBL(-)株に比べて、広い範囲でバイオフィルムを形成する能力が高いことを指摘している。 しかし、今回の研究ではそのような相関関係は見られなかった。
Wasfiらは、バイオフィルムに対する抗生物質の阻害効果を調べた。
Wasfiらは、4種類のP. mirabilis株が付着した場合に、ciprofloxacin、ceftriaxone、nitrofurantoin、gentamycinのsub-MICの影響を調べた。 その結果，すべての抗生物質の0.5 MICがバイオフィルム形成を抑制し，その減少率は85.0～90.0％であった。
Nucleoらは、バイオフィルム形成能に対する抗生物質の誘導的な影響を証明した。
Nucleoらは、バイオフィルム形成能に対する抗生物質の誘導効果を証明した。彼らは、イミペネムとタゾバクタムの濃度を上げると、試験した10種類のP.
現在の文献では、異なる成熟段階にあるP. mirabilisのバイオフィルムに対する抗生物質の影響に関する情報が不足しています。 今回の研究では、シプロフロキサシンはその濃度や菌株の由来にかかわらず、24時間バイオフィルムの場合、12時間バイオフィルムに比べてより効率的にバイオフィルム形成細胞を根絶することがわかった。 Ceftazidimeは、12時間対応の場合に、より高いバイオフィルムの排除効果を示した。
5. 結論
バイオフィルムを形成する微生物に対するsub-MICの抗生物質濃度を知ることは、合理的な抗生物質治療に役立つ。 今回発表した結果や他の著者の結果から、様々な微生物が様々な抗生物質のサブインヒビター濃度に対して多様なフィードバックを示すことが証明された。 抗生物質治療の際、微生物の一部は抑制下濃度の薬剤の影響を受ける。 様々な微生物によって形成されたバイオフィルムへの影響や、薬の薬力学的な指標についての詳細な知識は、バイオフィルムによって引き起こされる感染症の治療に有用である。
今回の研究により、P. mirabilisのバイオフィルムに対する抗生物質の効果は、バイオフィルムの成熟度や菌株の由来によって異なることが証明された。
今回の研究では、P.mirabilisのバイオフィルムに対する抗生物質の効果は、その成熟度や株の由来によって異なることが明らかになった。
Conflict of Interests
著者は潜在的な利益相反を報告していません。
Acknowledgment
この研究は、ニコラウス・コペルニクス大学の微生物学部の研究能力維持のための資金により、財政的に支援されました。